由羊肝素衍生的寡糖混合物及其制备方法与应用技术

本发明专利技术提供了一由羊肝素衍生的寡糖混合物及其制备方法与应用，所述寡糖混合物的重均分子量

【技术实现步骤摘要】
由羊肝素衍生的寡糖混合物及其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，涉及一种由羊肝素衍生的寡糖混合物
、
制备方法及其在治疗和预防凝血栓塞疾病中的用途
。

技术介绍

[0002]肝素
(Heparin)
及低分子肝素
(Low Molecular Weight Heparin
，
LWMH)
，是重要的临床抗凝抗栓药物
。
分子结构上，它们主要由氨基葡萄糖
(D
‑
glucosamine
，
GlcN)
和两种糖醛酸
(
艾杜糖醛酸
(L
‑
iduronic
，
IdoA)
和葡萄糖醛酸
(D
‑
glucuronic
，
GlcA))
中的一种组成二糖重复单元，且在糖单元的不同位置随机修饰有硫酸酯基
。
它们的结构可以用一个四糖单元表示，如下所示的
A
和
B
，而
C
则显示肝素与抗凝血酶结合的五糖结构，这是维持抗凝活性所必需的核心结构
。
[0003][0004]由上图可知，肝素的结构会因糖单元数量
、
种类以及硫酸酯基的修饰数量
、
位置等不同而纷繁差异
。
肝素寡糖链中的主要部分为结构有序的“规则区”——
结构规整的三硫酸化二糖重复单元
——I2S
‑
GlcNS6S(2
‑
氧
‑
硫酸基
‑
艾杜糖醛酸
‑
氮
‑
硫酸基
‑6‑
氧硫酸基
‑
葡萄糖胺
)
，如
A
所示；而
B
所示为低硫酸化区域，是结构无序的“不规则区”，主要是一些含
IdoA(
艾杜糖醛酸
)
和
GlcA(
葡萄糖醛酸
)(
其后连有
N
‑
乙酰基
‑
GlcN
或
N
‑
硫酸基
‑
GlcN(GlcNAc
，
GlcNS))
的单元
[R.J.Linhardt
，
J.Med.Chem.46
，
(2003)2551
‑
2564.]，
B
部分在肝素寡糖链中含量较小
。
另外，
C
显示了肝素与抗凝血酶结合位点的五糖结构，粗体表示的是维持抗凝活性所必需的，如除去则抗凝活性下降
95
％，斜体表示的也很重要，脱去后抗凝活性将下降
25
‑
50
％
。
[0005]相比于重均分子量数千至数万的大分子精品肝素，低分子肝素的重均分子量小，一般重均分子量在
3000Da
～
8000Da
不等，且分布更为集中
。
低分子肝素具有生物利用度好，
引起的大出血风险等副作用小的优点
。
目前主流市场
(
美国
、
中国及欧洲
)
的医用低分子肝素主要有：那曲肝素
(Nadroparin)、
达肝素
(Dalteparin)、
依诺肝素
(Enoxaparin)、
亭扎肝素
(Tinzaparin)、
帕肝素
(Parnaparin)
和贝米肝素
(Bemiparin)
等等，都来源于猪肠粘膜肝素
。
这些低分子肝素虽然都是由天然大分子肝素而来，但制备工艺各不相同，从而分子结构也显著不同
。
[0006]在低分子肝素的工艺生产中，肝素糖链往往会被选择性断裂或修饰，从而产生一些特殊的结构
。
如利用解聚工艺生产时，寡糖链中葡萄糖胺的6‑
位在碱性或加热时，脱硫酸酯基并进一步脱水形成内醚结构
[Mascellani
，
et al.Carbohydr.Res.(2007)342
，
835
‑
842.]，碱的作用还会引起艾杜糖
[IdoA(2S)]的2‑
O
位脱硫酸酯基并脱水形成2，3‑
环氧化合物
(2
，
3Epoxide)
或半乳糖醛酸
(Galacturonic acid
，
GalA)[Mourier
，
P.A.J.
；
Viskov
，
Anal.Biochem.(2004)
，
332
，
299
‑
313.]，肝素酯化物在解聚发生
beta
‑
消除反应时引起非还原端产生不饱和糖醛酸
[T.Toida
，
J.CarbohydrateChemistry
，
(1996)15(3)
，
351
‑
360.]，这些都是一些低分子肝素中可能存在的特殊结构
。
此外，肝素是大小不一糖链的混合物，同一堆肝素中的不同糖链分子，单糖组成序列往往是不同的，因此在制备低分子肝素的解聚时，糖链的断裂点也是多样的，而断裂往往更容易发生在多硫酸化的区域
[CasuB.et al.ElsevierLtd
；
(2006)
：1‑
28]，这会影响低分子肝素中的各糖链分子中的硫酸化比例
。
[0007]众所周知，其他物种或器官来源的肝素如羊肝素和牛肝素
(
包括牛肠粘膜肝素和牛肺肝素
)
等等，与猪肠粘膜肝素相比，虽然理化和生物学性质相似，但在糖链的分子结构和单元组成等特征上有不同程度的差异
[Zhang
，
F.
，
et al.Anal Bioanal Chem(2011)401
：
2793.]，这是可以分别归类的来源差异
。
如果能利用其他来源肝素制备符合医用需求的低分子肝素，将会是临床猪源低分子肝素的重要有益补充，可以丰富医用肝素的来源
。
但这种方式也必然会带来因种属或工艺引起的独特结构，潜在地可带来一定的生物学活性差异
。
非猪源原料或产品通常具有清真性，经济价值巨大
。
[0008]低分子肝素的制备和分析表征纷繁复杂，工艺本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种寡糖混合物，其特征在于：由羊肝素衍生制备，为大小不一寡糖链组成的混合物，主要结构式如下，其中：
n
＝1‑
24
；
R1＝
H
或
SO3Na
或
COCH3；
R2＝
H
或
SO3Na
；
R3＝
H
或所述寡糖混合物的重均分子量为
4000Da
‑
5000Da
；所述寡糖混合物的各个寡糖链的非还原端为4，5‑
不饱和糖醛酸结构，包括4，5‑
不饱和糖醛酸
‑2‑
O
‑
硫酸酯
(
Δ
U
2S
)
及4，5‑
不饱和糖醛酸
(
Δ
U)
两种，如下，所述寡糖混合物的部分寡糖链的还原端为内醚结构，包括
Anhydro Δ
IIS/Anhydro Δ
IIS
epi
、Anhydro Δ
IS
和
Anhydro Δ
IS
‑
IS
epi
，如下，
2.
如权利要求1所述的一种寡糖混合物，其特征在于：具有以下八个特点，
(1)
含有特殊的单糖结构，包括：不饱和糖醛酸结构
、
内醚结构
、
环氧以及半乳糖醛酸结构；其中不饱和糖醛酸结构位于寡糖链的非还原端，内醚结构位于部分寡糖链的还原端，而环氧和半乳糖醛酸结构则位于寡糖链的中间；
(2)
二糖及基本组成单元，
80
％以上为常见的肝素二糖，包括：
Δ
IS(
Δ
UA2S
‑
GlcNS6S)、
Δ
IIS(
Δ
UA
‑
GlcNS6S)、
Δ
IIIS(
Δ
UA2S
‑
GlcNS)、
Δ
IVS(
Δ
UA
‑
GlcNS)、
Δ
IA(
Δ
UA2S
‑
GlcNAc6S)、
Δ
IIA(
Δ
UA
‑
GlcNAc6S)、
Δ
IIIA(
Δ
UA2S
‑
GlcNAc)
和
Δ
IVA(
Δ
UA
‑
GlcNAc)
；
(3)
四糖的非还原端均含4，5‑
不饱和糖醛酸
‑2‑
O
‑
硫酸酯
(
Δ
U
2S
)
结构，所述四糖为寡糖混合物中自然存在而不是经酶解得到的组分，种类包括：
Δ
U
2S
H
NS6S
U
gal
H
NS6S
(
β
)/I
2S
H
NS6S
I
2S
H
NS6S
、
Δ
U
2S
H
NS6S
U
ga1
H
NS6S
(
α
)/I
2S
H
NS6S
I
2S
H
NS6S
、
Δ
U
2S
H
NS6S
I
2S
H
NS
(
α
)、
Δ
U
2S
H
NS6S
I
2S
H
NS
(
β
)、
Δ
U
2S
H
NS6S
I
2S
Man
NS
(
β
)、
Δ
U
2S
H
NS6S
I
2S
Man
NS
(
α
)、
Δ
U
2S
H
NS
I
2S
H
NS6S
(
α
)、
Δ
U
2S
H
NS
I
2S
H
NS6S
(
β
)、
Δ
U
2S
H
NS6S
I
2S
Man
NS
(1
，
6anhydro)、
Δ
U
2S
H
NS6S
I
2S
H
NS
(1
，
6anhydro)、
Δ
U
2S
H
NS6S
G
2S
H
NS
、
Δ
U
2S
H
NS6S
GH
NS6S
(
α
)、
Δ
U
2S
H
NS6S
GH
NS6S
(
β
)、
Δ
U
2S
H
NS6S
I
2S
H
NS6S
(
α
)、
Δ

【专利技术属性】
技术研发人员：金永生，陆晓华，靳彩娟，姚亦明，
申请(专利权)人：苏州融析生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：