一种肝素钠的制备方法技术

本发明专利技术提供一种肝素钠的制备方法，该制备方法包括粗品除杂、酶解、酸性除杂、氧化、冻干、粉碎，能够去除肝素钠中丝氨酸，克服了现有技术中肝素钠制备方法不适宜大批量生产的局限，具有工艺操作简单，提高肝素结构完整度和效价。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于药学领域，涉及一种肝素及其衍生物，特别涉及一种肝素钠的制备方法。
技术介绍
肝素是由糠醛酸和氨基葡萄糖以1-4糖苷键连起来的重复二糖单元组成的线性粘多糖，其广泛分布于哺乳动物的组织中，由结缔组织性肥大细胞表达产生。肝素在动物体内大部分以肝素钠-蛋白复合物的形式存在。由于肝素钠解离不完全，肝素提取方法会残留以共价键结合的蛋白质和以静电结合的带正电蛋白质。目前，国内外发表了许多去除肝素中丝氨酸的方法，例如Keiichi Takagaki在2002年报道了采用具有β-内切木糖苷酶活性的纤维素酶去除肝素丝氨酸的方法；Yu-ki Matsuno在2007年报道了碱性条件下β-消除反应去除肝素丝氨酸的方法；Viskov等在2008年报道了用高锰酸钾除去丝氨酸的方法。上述前第一种方法和第二种方法都先要分离特定分子量的肝素片段，然后除去特定肝素片段的丝氨酸残基，不符合工业化生产要求。上述第三种方法对肝素的四糖连接区造成破坏性影响，不符合工业化生产要求。
技术实现思路
基于上述技术问题，本专利技术提供了一种肝素钠的制备方法，该制备方法能够去除肝素钠中丝氨酸，符合工业化生产要求。为了达到上述目的，本专利技术提供下述技术方案：一种肝素钠的制备方法，该制备方法包括如下步骤：1)在25～35℃下，以20％(g/mL)浓度将粗品肝素钠溶解于纯化水中，以4～5％(g/mL)的浓度加入氯化钠，待溶解后调节pH至10.0～10.5，搅拌3.5～4.0小时，然后升温至80～85℃，调节pH至9.5～10.0，静置10分钟，迅速降温至20℃以下，静置4～5小时后过滤，取滤液；2)将步骤1得到的滤液升温至45～50℃，用18％(g/mL)的盐酸水溶液或20％(g/mL)的氢氧化钠水溶液调节pH至8.0～9.0，加入胰酶反应4～5小时，再以2％(g/mL)的浓度加入氯化钙，搅拌溶解后升温至80～85℃，继续搅拌10分钟，再降温至40℃以下，以2％(g/mL)的浓度加入碳酸钠，持续搅拌30分钟，离心，取上清液；3)向步骤2得到的上清液补加清水至步骤1中粗品肝素钠水溶液的初始体积，升温至45～50℃，用18％(g/mL)盐酸水溶液调节pH至4.5～5.5，加入纤维素酶搅拌下反应6～8小时，加入氯化钙，搅拌溶解，升温至80～85℃，搅拌10分钟，降温至40℃以下，以2％(g/mL)的浓度加入碳酸钠，持续搅拌30分钟，离心，取上清液；4)向步骤3得到的上清液加入95％(体积比)乙醇水溶液，搅拌均匀，降温至0～5℃，调节pH至1.0～
2.0，离心，取上清液，迅速调节pH至6.0～7.0；5)向步骤4得到的上清液加入95％(体积比)乙醇水溶液至20℃下的乙醇浓度为40～45°，静置12～24小时，抽取上层乙醇，得湿沉淀；6)以30～35％(g/mL)的浓度将步骤5得到的湿沉淀溶解在纯化水中，加入25％(g/mL)的次氯酸水溶液，用18％(g/mL)的盐酸水溶液调节pH至4.5～5.0，20～30℃下静置6～8小时，调节pH至6.0～7.0，以1.5％(g/mL)的浓度加入氯化钠，搅拌溶解，加入95％(体积比)乙醇水溶液至20℃下的乙醇浓度为40～45°，静置6～8小时，抽去上层乙醇得到湿沉淀。7)以30～35％(g/mL)的浓度将步骤6得到的湿沉淀溶解在纯化水中，用20％(g/mL)的氢氧化钠水溶液调节pH至10.0～10.5，25～30℃下加入30％(g/mL)的过氧化氢水溶液，静置4小时，加入30％(g/mL)的过氧化氢水溶液，静置8小时，加入30％(g/mL)的过氧化氢水溶液，静置12小时，调节pH至6～7，过滤，得滤液。8)将上述步骤7的滤液冻干，粉碎。本专利技术能够达到如下有益效果：1)产品中肝素结构完整，不含丝氨酸残基，效价更高；2)符合USP和EP的检测标准。具体实施方式实施例11)在25℃下，以20％(g/mL)浓度将粗品肝素钠溶解于纯化水中，以4％(g/mL)的浓度加入氯化钠，待溶解后调节pH至10.0，搅拌3.5小时，然后升温至80℃，调节pH至9.5，静置10分钟，迅速降温至20℃以下，静置4小时后过滤，取滤液；2)将步骤1得到的滤液升温至45℃，用18％(g/mL)的盐酸水溶液或20％(g/mL)的氢氧化钠水溶液调节pH至8.0，加入胰酶反应4小时，再以2％(g/mL)的浓度加入氯化钙，搅拌溶解后升温至80℃，继续搅拌10分钟，再降温至40℃以下，以2％(g/mL)的浓度加入碳酸钠，持续搅拌30分钟，离心，取上清液；3)向步骤2得到的上清液补加清水至步骤1中粗品肝素钠水溶液的初始体积，升温至45℃，用18％(g/mL)盐酸水溶液调节pH至4.5，加入纤维素酶搅拌下反应6小时，加入氯化钙，搅拌溶解，升温至80℃，搅拌10分钟，降温至40℃以下，以2％(g/mL)的浓度加入碳酸钠，持续搅拌30分钟，离心，取上清液；4)向步骤3得到的上清液加入95％(体积比)乙醇水溶液，搅拌均匀，降温至0℃，调节pH至1.0，离心，取上清液，迅速调节pH至6.0；5)向步骤4得到的上清液加入95％(体积比)乙醇水溶液至20℃下的乙醇浓度为40°，静置12小时，
抽取上层乙醇，得湿沉淀；6)以30％(g/mL)的浓度将步骤5得到的湿沉淀溶解在纯化水中，加入25％(g/mL)的次氯酸水溶液，用18％(g/mL)的盐酸水溶液调节pH至4.5，20℃下静置6小时，调节pH至6.0，以1.5％(g/mL)的浓度加入氯化钠，搅拌溶解，加入95％(体积比)乙醇水溶液至20℃下的乙醇浓度为40°，静置6小时，抽去上层乙醇得到湿沉淀。7)以30％(g/mL)的浓度将步骤6得到的湿沉淀溶解在纯化水中，用20％(g/mL)的氢氧化钠水溶液调节pH至10.0，25℃下加入30％(g/mL)的过氧化氢水溶液，静置4小时，加入30％(g/mL)的过氧化氢水溶液，静置8小时，加入30％(g/mL)的过氧化氢水溶液，静置12小时，调节pH至6，过滤，得滤液。8)将上述步骤7的滤液冻干，粉碎。实施例21)在35℃下，以20％(g/mL)浓度将粗品肝素钠溶解于纯化水中，以5％(g/mL)的浓度加入氯化钠，待溶解后调节pH至10.5，搅拌4.0小时，然后升温至85℃，调节pH至10.0，静置10分钟，迅速降温至20℃以下，静置5小时后过滤，取滤液；2)将步骤1得到的滤液升温至50℃，用18％(g/mL)的盐酸水溶液或20％(g/mL)的氢氧化钠水溶液调节pH至9.0，加入胰酶反应5小时，再以2％(g/mL)的浓度加入氯化钙，搅拌溶解后升温至85℃，继续搅拌10分钟，再降温至40℃以下，以2％(g/mL)的浓度加入碳酸钠，持续搅拌30分钟，离心，取上清液；3)向步骤2得到的上清液补加清水至步骤1中粗品肝素钠水溶液的初始体积，升温至50℃，用18％(g/mL)盐酸水溶液调节pH至5.5，加入纤维素酶搅拌下反应8小时，加入氯化钙，搅拌溶解，升温至85℃，搅拌10分钟，降温至40℃以下，以2％(g/mL)的浓度加入碳酸钠，持续搅拌30分钟，离心，取上清液；4)向步骤3得到的上清液加入本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肝素钠的制备方法，其特征在于，该制备方法包括如下步骤：1)在25～35℃下，以20％(g/mL)浓度将粗品肝素钠溶解于纯化水中，以4～5％(g/mL)的浓度加入氯化钠，待溶解后调节pH至10.0～10.5，搅拌3.5～4.0小时，然后升温至80～85℃，调节pH至9.5～10.0，静置10分钟，迅速降温至20℃以下，静置4～5小时后过滤，取滤液；2)将步骤1得到的滤液升温至45～50℃，用18％(g/mL)的盐酸水溶液或20％(g/mL)的氢氧化钠水溶液调节pH至8.0～9.0，加入胰酶反应4～5小时，再以2％(g/mL)的浓度加入氯化钙，搅拌溶解后升温至80～85℃，继续搅拌10分钟，再降温至40℃以下，以2％(g/mL)的浓度加入碳酸钠，持续搅拌30分钟，离心，取上清液；3)向步骤2得到的上清液补加清水至步骤1中粗品肝素钠水溶液的初始体积，升温至45～50℃，用18％(g/mL)盐酸水溶液调节pH至4.5～5.5，加入纤维素酶搅拌下反应6～8小时，加入氯化钙，搅拌溶解，升温至80～85℃，搅拌10分钟，降温至40℃以下，以2％(g/mL)的浓度加入碳酸钠，持续搅拌30分钟，离心，取上清液；4)向步骤3得到的上清液加入95％(体积比)乙醇水溶液，搅拌均匀，降温至0～5℃，调节pH至1.0～2.0，离心，取上清液，迅速调节pH至6.0～7.0；5)向步骤4得到的上清液加入95％(体积比)乙醇水溶液至20℃下的乙醇浓度为40～45°，静置12～24小时，抽取上层乙醇，得湿沉淀；6)以30～35％(g/mL)的浓度将步骤5得到的湿沉淀溶解在纯化水中，加入25％(g/mL)的次氯酸水溶液，用18％(g/mL)的盐酸水溶液调节pH至4.5～5.0，20～30℃下静置6～8小时，调节pH至6.0～7.0，以1.5％(g/mL)的浓度加入氯化钠，搅拌溶解，加入95％(体积比)乙醇水溶液至20℃下的乙醇浓度为40～45°，静置6～8小时，抽去上层乙醇得到湿沉淀；7)以30～35％(g/mL)的浓度将步骤6得到的湿沉淀溶解在纯化水中，用20％(g/mL)的氢氧化钠水溶液调节pH至10.0～10.5，25～30℃下加入30％(g/mL)的过氧化氢水溶液，静置4小时，加入30％(g/mL)的过氧化氢水溶液，静置8小时，加入30％(g/mL)的过氧化氢水溶液，静置12小时，调节pH至6～7，过滤，得滤液；8)将上述步骤7的滤液冻干，粉碎。...

【技术特征摘要】
1.一种肝素钠的制备方法，其特征在于，该制备方法包括如下步骤：1)在25～35℃下，以20％(g/mL)浓度将粗品肝素钠溶解于纯化水中，以4～5％(g/mL)的浓度加入氯化钠，待溶解后调节pH至10.0～10.5，搅拌3.5～4.0小时，然后升温至80～85℃，调节pH至9.5～10.0，静置10分钟，迅速降温至20℃以下，静置4～5小时后过滤，取滤液；2)将步骤1得到的滤液升温至45～50℃，用18％(g/mL)的盐酸水溶液或20％(g/mL)的氢氧化钠水溶液调节pH至8.0～9.0，加入胰酶反应4～5小时，再以2％(g/mL)的浓度加入氯化钙，搅拌溶解后升温至80～85℃，继续搅拌10分钟，再降温至40℃以下，以2％(g/mL)的浓度加入碳酸钠，持续搅拌30分钟，离心，取上清液；3)向步骤2得到的上清液补加清水至步骤1中粗品肝素钠水溶液的初始体积，升温至45～50℃，用18％(g/mL)盐酸水溶液调节pH至4.5～5.5，加入纤维素酶搅拌下反应6～8小时，加入氯化钙，搅拌溶解，升温至80～85℃，搅拌10分钟，降温至40℃以下，以2％(g/mL)的浓度加入碳酸钠，持续搅拌30分钟，离心，取上清液；4)向步骤3得...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨军，
申请(专利权)人：北京海吉星医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11