琼胶寡糖水解酶及通过使用该琼胶寡糖水解酶从琼脂糖中生成3,6-脱水-L-半乳糖和半乳糖的方法技术

本发明专利技术涉及琼胶寡糖水解酶及一种通过利用该琼胶寡糖水解酶从琼脂糖中生成3,6‑脱水‑L‑半乳糖和半乳糖的方法。更具体地，通过使用对琼脂三糖具有水解活性的β‑琼胶寡糖水解酶，提高来自琼脂糖中的3,6‑脱水‑L‑半乳糖和半乳糖的产率，即糖化率。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种对琼胶寡糖具有水解活性的新型β-琼胶寡糖水解酶，且还涉及一种通过使用β-琼胶寡糖水解酶从琼脂糖中生成3,6-脱水-L-半乳糖和半乳糖的方法。
技术介绍
相比于最近在诸多领域中使用的植物生物量，藻类具有含量较低的难以利用的成分，如所使用的木质素。因此，藻类的优点在于，它们可以更为容易地转化成作为用来生成生物能源和生化物的基底的单糖。此外，通过不去使用食物资源，藻类则不存在使用食物资源来生成能源的问题。基于这些原因，在生成包括有可替代能源的生化物质上，藻类作为重要生物量而备受关注。在藻类中，尤其，红藻（如，石花菜（Gelidiumamansii））不仅是生成这种生物能源和生化物质的原材料，据报道，它还含有琼胶寡糖（agarooligosaccharides），而被用作成分的琼胶寡糖显示出优异的生理活性，如抗氧化、抗炎、抗癌、抗过敏、美白和保湿性，从而在制药和化妆品领域中红藻被有效使用（U.S.PatentNo.76622291byTomonoetal.(2009);U.S.PatentNo.691143282byEnokietal.(2005)）。红藻包含作为主要组成的琼脂糖，琼脂糖为以新琼脂二糖（neoagarobiose）（即，通过α-1,3-键相结合的3,6-脱水-L-半乳糖和D-半乳糖）作为基本单元的聚合物，其中作为基本单元的新琼脂二糖与其他单元通过β-1,4-键相连。本专利技术的专利技术人以实验为依据证明了3,6-脱水-L-半乳糖的生理功能起源于包含有新琼脂二糖的琼胶寡糖（Yunetal(2013)ApplMicrobiolBiotechnol.97(7):2961-70）的这一事实。此外，据报道，关于3,6-脱水-L-半乳糖的生成，有一种通过温和的化学预处理和酶糖化制备3,6-脱水-L-半乳糖和D-半乳糖的过程，来替代产率极低且具有水解过度的可能性高的化学处理方法（Joletal(1999)AnalBiochem.268,213-222;Kimetal(2010)BullKoreanSoc.31(2)511-514）。待经过化学预处理后，琼脂糖被外切型Aga50D酶解聚成作为主要反应产物的新琼脂二糖和琼脂三糖（agarotriose）（D-半乳糖-β-1,4键-3,6-脱水-L-半乳糖-α-1,3键-D-半乳糖）。然后，新琼脂二糖被作为α-琼脂二糖水解酶的SdNABH最终水解成3,6-脱水-L-半乳糖和D-半乳糖（韩国专利号10-1293668）。期间，在温和条件下的化学预处理对提高所述Aga50D酶的反应性来说是不可或缺的。然而，通过使用经化学预处理的基底，所生成的琼脂三糖最终无法被分解成3,6-脱水-L-半乳糖和D-半乳糖，反而作为反应剩余物被残留下来。如果所残留的琼脂三糖最终可以被分解成3,6-脱水-L-半乳糖和D-半乳糖时，能够预期的是，3,6-脱水-L-半乳糖和D-半乳糖的产量将得到更大的提高。由于内切型和外切型β-琼胶酶无法水解如琼脂三糖的基底，也尝试过另一种通过利用β-半乳糖苷酶将琼脂三糖分解成D-半乳糖和新琼脂二糖的方法，然而可商购的β-半乳糖苷酶并没有展示出对琼脂寡糖的水解活性。
技术实现思路
技术问题本专利技术在于，提供一种通过使用新型酶提高琼脂糖糖化的效率的方法，且所述新型酶对琼脂寡糖具有水解活性。本专利技术还在于，提供一种通过使用新型酶生成半乳糖的方法，且所述新型酶对琼脂寡糖具有水解活性。技术方案为了实现上述目的，本专利技术提供一种用于琼脂糖糖化的组合物，该组合物包含：琼胶酶；对琼脂三糖具有水解活性且以氨基酸序列SEQIDNO:1表示的β-琼胶寡糖水解酶；和α-琼脂二糖水解酶。本专利技术还提供一种通过使基底与本专利技术的用于琼脂糖糖化的组合物进行反应来糖化琼脂糖的方法，其中所述基底选自琼脂糖、琼脂三糖和新琼脂二糖。本专利技术还提供一种用于生成半乳糖的组合物，该组合物包含β-琼胶寡糖水解酶，且所述β-琼胶寡糖水解酶对琼脂三糖、琼脂戊糖（agaropentaose）或琼脂庚糖（agaroheptaose）具有水解活性并被表示为氨基酸序列SEQIDNO:1。此外，本专利技术提供一种通过使基底与本专利技术的β-琼胶寡糖水解酶反应来生成半乳糖的方法，其中所述基底选自琼脂三糖、琼脂戊糖和琼脂庚糖。有益效果通过利用能将琼脂三糖水解成半乳糖和新琼脂二糖上表现出活性的β-琼胶寡糖水解酶，本专利技术有效地提高了来自琼脂糖的3,6-脱水-L-半乳糖和D-半乳糖的产量，也就是说，有效地改善了糖化产量。附图说明图1为用于各种酶（PA：经预处理的琼脂糖；PAS：相对于所述经预处理的琼脂糖的Aga50D和SdNABH的反应产物；PASV：相对于所述经预处理的琼脂糖的Aga50D、SdNABH与附加弧菌EJY3初始提取物时的反应产物）的反应产物的TLC照片。图2以柱形图总结并展示了通过DNS试验对图1的PAS和PASV的还原当量。图3为本专利技术的经提纯的β-琼胶寡糖水解酶的SDS-PAGE照片。图4展示了本专利技术的β-琼胶寡糖水解酶的最佳温度的pH结果。图4A展示了所述β-琼胶寡糖水解酶相对于琼脂三糖基底的最佳pH，而图4B展示了所述β-琼胶寡糖水解酶相对于琼脂三糖基底的最佳温度（M:蛋白标记；第1道：通过HisTrapHP柱经过第一次提纯的β-琼胶寡糖水解酶：第2道：通过HisTrapQFF柱经过第二次提纯的β-琼胶寡糖水解酶）。图5证明了本专利技术的β-琼胶寡糖水解酶对琼脂三糖基底的酶活性。图5A为随着所述β-琼胶寡糖水解酶与琼脂三糖基底之间的各反应时间所显示的所述基底和产物的变化的HPLC结果，而图5B为随着所述β-琼胶寡糖水解酶和α-琼脂二糖水解酶与琼脂三糖基底之间的各反应时间所显示的所述基底和产物的变化的HPLC结果。图6展示了本专利技术的β-琼胶寡糖水解酶相对于琼脂三糖、琼脂戊糖和琼脂庚糖基底的酶活性。图6A通过利用TLC展示了所述β-琼胶寡糖水解酶相对于每种基底的反应产物，而图6B通过利用TLC展示了所述β-琼胶寡糖水解酶和α-琼脂二糖水解酶相对于每种基底的反应产物。图7展示了本专利技术的β-琼胶寡糖水解酶相对于各种基底（使用葡萄糖和半乳糖作为基底）的酶活性。图8展示了源自大肠杆菌的β-半乳糖苷酶相对于各种基底（使用葡萄糖和半乳糖作为基底）的酶活性。图8A展示了分别相对于乳糖、乳糖-N-新四糖、乳果糖、4-β-半乳糖和α-1,3-β-1,4-半乳二糖的酶的反应的结果，而图8B展示了分别相对于琼脂三糖、琼脂戊糖和琼脂庚糖的酶的反应的结果。图9为通过使用本专利技术的β-琼胶寡糖水解酶（β-AOH）所展示的琼脂糖糖化过程的示意图。具体实施方式下面，将具体说明本专利技术的构成。本专利技术涉及一种用于琼脂糖糖化的组合物，该组合物包含：琼胶酶；对琼脂三糖具有水解活性且以氨基酸序列SEQIDNO:1表示的β-琼胶寡糖水解酶；和α-琼脂二糖水解酶。本专利技术的用于琼脂糖糖化的组合物的特征在于，通过在琼脂糖糖化中利用能够水解琼脂三糖的β-琼胶寡糖水解酶来有效地分解那些过去在常规领域中不能水解而残留下来的琼脂三糖，其中β-琼胶寡糖水解酶能使作为琼脂寡糖的产物的琼脂三糖水解成新琼脂二糖和D-半乳糖，从而显著地改善来自琼脂糖的3,6-脱水-L-半乳糖和D-半乳本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于琼脂糖糖化的组合物，该组合物包含：琼胶酶；对琼脂三糖具有水解活性且以氨基酸序列SEQ ID NO:1表示的β‑琼胶寡糖水解酶；和α‑琼脂二糖水解酶。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.10.14 KR 10-2013-01219901.一种用于琼脂糖糖化的组合物，该组合物包含：琼胶酶；对琼脂三糖具有水解活性且以氨基酸序列SEQIDNO:1表示的β-琼胶寡糖水解酶；和α-琼脂二糖水解酶。2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述琼胶酶用氨基酸序列SEQIDNO:3表示。3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述β-琼胶寡糖水解酶能将琼脂三糖水解成D-半乳糖和新琼脂二糖。4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述β-琼胶寡糖水解酶源自弧菌EJY3。5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述α-琼脂二糖水解酶用氨基酸序列SEQIDNO:4表示。6.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，通过使经预处理的琼脂糖与所述琼胶酶、所述β-琼胶寡糖水解酶和α-琼脂二糖水解酶的酶混合物反应，或者通过使所述琼胶酶、所述β-琼胶寡糖水解酶和α-琼脂二糖水解酶相继与所述经预处...

【专利技术属性】
技术研发人员：金京宪，崔仁杰，李赞炯，金希泽，尹银珠，
申请(专利权)人：高丽大学校产学协力团，
类型：发明
国别省市：韩国;KR