一种硫酸化肝素寡糖及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种硫酸化肝素寡糖及其制备方法和应用，其特征在于，所述硫酸化肝素寡糖分子的非还原端含有由肝素酶酶解产生的不饱和双键，含有糖醛酸衍生物和糖胺衍生物，其具有式I所示结构，其中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、Ra、Rb、Rc和Rd独立地为SO3-或H；Rx'、Ry'和Rz'独立地为COCH3或SO3-，n为1-3。通过本发明专利技术的制备方法制备得到硫酸化程度可控的硫酸化寡糖，该硫酸化肝素寡糖的体外抑制乙酰肝素酶活性很高，其抑制细胞粘附和迁移的活性高出肝素4-5倍，小鼠体内抗肿瘤转移的活性也比肝素高2-3倍，具有较好的抗肿瘤转移效果和较高的特异性。

Sulfated heparin oligosaccharide and preparation method and application thereof

The invention provides a sulfated heparin oligosaccharide and preparation method and application thereof, which is characterized in that the non reducing end of the sulfated heparin oligosaccharide molecules containing heparin produced by enzyme hydrolysis of the unsaturated double bond containing uronic acid derivatives and sugar amine derivatives, which has the structure shown in formula I, among them, R1 R3, R4, R2, R5, R6, R7, R8, R9, Ra, Rc, Rb, and Rd are independently SO3- or H; Rx', Ry' and Rz'independently of COCH3 or SO3-, n 1-3. Sulfated oligosaccharides by the preparation method of the invention is prepared by sulfation degree controllable, the sulfated heparin oligosaccharides in vitro inhibition of heparanase activity is very high, the inhibition of cell adhesion and migration activity is higher than heparin 4-5 times, anti metastatic activity of mice is 2-3 times higher than heparin, with specific anti tumor metastasis effect and higher good.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于抗肿瘤药物领域，涉及一种硫酸化肝素寡糖及其制备方法和应用。
技术介绍
肿瘤是人类健康的重大威胁，更严重的是，肝癌、肺癌等恶性肿瘤易发生转移，目前尚无抑制肿瘤转移的药物，导致肿瘤转移治疗困难，使肿瘤转移成为肿瘤患者死亡的最重要原因。肿瘤细胞要实现侵袭和迁移，有两个过程非常关键：一是突破由细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)和基膜(basementmembrane，BM)构成的屏障,二是形成新生血管。ECM和BM是肿瘤细胞侵袭及转移的屏障，恶性肿瘤细胞要实现扩散和转移，必须穿过ECM及BM进入循环。在这个过程中ECM各种成分和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparansulfateproteoglycans，HSPGs)的降解必不可少。乙酰肝素酶(heparanase，HPA)是目前发现的哺乳动物体内唯一能切割硫酸乙酰肝素(heparansulfate,HS)的内切-β-D-葡萄糖醛酸酶。HPA识别HS的特异结构，不完全切割HS侧链，只在某些位点切割HS侧链的糖苷键，将其降解为10-15个糖单位大小的短糖链。另外，HS侧链可以结合很多生物活性分子如生长因子、细胞因子、趋化因子、成形素和凝血蛋白等。HPA通过降解HS释放活性生长因子，这些生长因子能促进肿瘤血管生成、肿瘤生长、侵袭和转移。因此，HPA对肿瘤细胞的侵袭和转移具有重要作用，而HPA抑制剂的研究和筛选已成为人类寻找癌症治疗潜在药物的新方向。长期以来的临床证据显示肝素具有抗肿瘤功能，且近年来低分子肝素辅助抗肿瘤正在开展临床试验。经过长期的研究，肝素的抗肿瘤作用在业界已得到普遍的认识和认可，肝素的抗肿瘤可能主要是通过抑制肿瘤转移进行体现，更进一步体现为抑制体内乙酰肝素酶的活性。肝素作为传统抗凝血药，其抗凝血活性是主要用途，但其结构的多样性导致其具有多种生物活性。在肝素的非抗凝应用中，其抗凝血活性是常见的和中药的副作用。因此，肝素的抗凝活性是其抗肿瘤转移方面应用的一个重大不利因素，容易引起出血等副作用。肝素的非抗凝活性应用中一个重要的研究方面就是在保留肝素基本结构的基础上，破坏其抗凝血活性。在抗肿瘤转移方面，肝素的乙酰肝素酶抑制活性较高高，但细胞层次上对肿瘤生长抑制、肿瘤细胞侵袭和粘附的抑制活性都不显著，在抗肿瘤转移小鼠实验中结果较差，不能显著的抑制肿瘤转移的发生。其中主要的原因可能是肝素的特异性不高，可以和多种内源性物质发生作用，降低了与乙酰肝素酶结合的能力。CN101824100A公开了具有如下结构式的肝素寡糖十二聚体：该肝素寡糖时十二聚体具有抗血管平滑肌细胞增殖的用途。但是该专利技术的寡糖并不具有显著的抑制肿瘤细胞粘附和迁移的能力。CN104764847A公开了含N-乙酰化结构肝素寡糖的制备方法，在该对比文件中公开了以下4种六糖和3种八糖片段：dp6a△HexA-GlcNS-HexA-GlcNS-HexA2S-GlcNS6S；dp6b△HexA2S-GlcNS6S-HexA2S-GlcNAc-HexA2S-GlcNS6S；dp6c△HexA-GlcNS6S-HexA-GlcNAc6S-HexA2S-GlcNS6S；dp6d△HexA-GlcNS6S-HexA2S-GlcNAc6S-HexA2S-GlcNS6S；dp8a△HexA2S-GlcNS-[HexA2S-GlcNAc-HexA-GlcNS]-HexA2S-GlcNS6S；dp8b△HexA2S-GlcNS6S-[HexA2S-GlcNAc-HexA-GlcNS]-HexA2S-GlcNS6S；dp8c△HexA2S-GlcNS6S-[HexA2S-GlcNAc-HexA-GlcNAc6S]-HexA2S-GlcNS6S；该专利技术仅是解决了含N-乙酰化结构肝素寡糖难制备以及结构测定问题，在抑制体内乙酰肝素酶的活性方面并无显著改善。因此，在本领域中，期望能够得到一种具有抑制体内乙酰肝素酶活性，并能降低其抗凝血活性的肝素寡糖。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种硫酸化肝素寡糖及其制备方法和应用。为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供一种硫酸化肝素寡糖，所述硫酸化肝素寡糖分子的非还原端含有由肝素酶酶解产生的不饱和双键，含有糖醛酸衍生物和糖胺衍生物，其具有式I所示结构：其中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、Ra、Rb、Rc和Rd独立地为SO3-或H；Rx′、Ry′和Rz′独立地为COCH3或SO3-，n为1-3。在本专利技术中n为1-3，即为1、2或3，当n＝1时，所述硫酸化肝素寡糖为硫酸肝素六糖，当n＝2时，所述硫酸化肝素寡糖为硫酸肝素八糖，当n＝3时，所述硫酸化肝素寡糖为硫酸肝素十糖。在本专利技术硫酸化肝素寡糖的结构中有双键，所以该硫酸化肝素寡糖在紫外区232nm附近有较强的吸收峰，可以非常方便的用于肝素寡糖的定性和定量检测。本专利技术的硫酸肝素寡糖具有良好的乙酰肝素酶抑制活性和抑制肿瘤转移活性，其糖链较短，分子量小，完全没有抗凝血活性，同时硫酸化肝素寡糖具有较高的特异性，能特异性的抑制乙酰肝素酶，抑制肿瘤转移。在本专利技术所述的硫酸化肝素寡糖中，式I中平均每个双糖单元中磺酸基个数不少于2个，例如平均每个双糖单元中磺酸基个数可以为2个、3个、4个或5个，平均每个双糖单元中乙酰基不多于0.5个，例如可以是0.5个或0.4个，平均每个双糖单元的葡萄糖胺6-位和3-位磺酸基都不少于0.5个，例如可以是0.5个、0.8个、1个、1.5个或2个。所述每个双糖单元中基团(例如磺酸基、乙酰基或葡萄糖胺6-位和3-位磺酸基)的个数是指以整个肝素寡糖中磺酸基的个数平均到每个双糖单元所得到的个数，例如如果硫酸化肝素八糖中有共有2个乙酰基，则平均到每个双糖单元中乙酰基的数量为0.5个。优选地，式I中糖醛酸为葡萄糖醛酸或艾杜糖醛酸。优选地，与式I中所含羧基和/或磺酸基成盐的阳离子选自Na+、K+或Ca2+。上述结构式中，葡萄糖醛酸中的羧基或者磺酸基都带有负电荷，因此一般要与一些阳离子成盐，通常是Na+、K+和Ca2+。优选地，所述硫酸化肝素寡糖为具有以下结构的化合物中的任意一种或至少两种的组合：DP6肝素六糖衍生物：ΔU3S-ANS3S-I-ANS3S-G3S-ANS3S6SΔU3S-ANS-I3S-ANS3S-G3S-ANS3S6SΔU2S3S-A本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种硫酸化肝素寡糖，其特征在于，所述硫酸化肝素寡糖分子的非还原端含有由肝素酶酶解产生的不饱和双键，含有糖醛酸衍生物和糖胺衍生物，其具有式I所示结构：其中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、Ra、Rb、Rc和Rd独立地为SO3‑或H；Rx'、Ry'和Rz'独立地为COCH3或SO3‑，n为1‑3。

【技术特征摘要】
1.一种硫酸化肝素寡糖，其特征在于，所述硫酸化肝素寡糖分子的非还
原端含有由肝素酶酶解产生的不饱和双键，含有糖醛酸衍生物和糖胺衍生物，
其具有式I所示结构：
其中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、Ra、Rb、Rc和Rd独立地为
SO3-或H；Rx'、Ry'和Rz'独立地为COCH3或SO3-，n为1-3。
2.根据权利要求1所述的硫酸化肝素寡糖，其特征在于，式I中平均每个
双糖单元中磺酸基个数不少于2个，平均每个双糖单元中乙酰基不多于0.5
个，平均每个双糖单元的葡萄糖胺6-位和3-位磺酸基都不少于0.5个；
优选地，式I中糖醛酸为葡萄糖醛酸或艾杜糖醛酸；
优选地，与式I中所含羧基和/或磺酸基成盐的阳离子选自Na+、K+或
Ca2+。
3.根据权利要求1或2所述的硫酸化肝素寡糖，其特征在于，所述硫酸化
肝素寡糖为具有以下结构的化合物中的任意一种或至少两种的组合：
DP6肝素六糖衍生物：
ΔU3S-ANS3S-I-ANS3S-G3S-ANS3S6SΔU3S-ANS-I3S-ANS3S-G3S-ANS3S6SΔU2S3S-ANS3S6S-I3S-ANS3S-G2S3S-ANS3S6SΔU2S3S-ANS3S6S-I3S-ANS3S6S-G3S-ANS3S6SΔU2S3S-ANS3S6S-I3S-ANS3S6S-G2S3S-ANS3S6SΔU2S3S-ANS3S6S-I2S3S-ANS3S6S-G2S3S-ANS3S6SDP8肝素八糖衍生物：
ΔU3S-ANS3S-I-ANS3S-I3s-ANS6S-G3S-ANS3S6SΔU3S-ANS-I3S-ANS3S-I3S-ANS6S-G3S-ANS3S6SΔU2S3S-ANS3S6S-I3S-ANS3S-I3S-ANS6S-G2S3S-ANS3S6SΔU2S3S-ANS3S6S-I3S-ANS3S6S-I3S-ANS6S-G3S-ANS3S6SΔU2S3S-ANS3S6S-I3S-ANS3S6S-I3S-ANS6S-G2S3S-ANS3S6SΔU2S3S-ANS3S6S-I2S3S-ANS3S6S-I2S3S-ANS6S-G2S3S-ANS3S6SDP10肝素十糖衍生物：
ΔU3S-ANS3S-I-ANS3S-I-ANS6S-I-ANS6S-G3S-ANS3S6SΔU3S-ANS-I3S-ANS3S-I3S-ANS6S-I3S-ANS6S-G3S-ANS3S6SΔU2S3S-ANS3S6S-I3S-ANS3S-I3S-ANS6S-I3S-ANS6S-G3S-ANS3S6SΔU2S3S-ANS3S6S-I3S-ANS3S6S-I3S-ANS6S-I3S-ANS6S–G2S3S-ANS3S6SΔU2S3S-ANS3S6S-I2S3S-AN...

【专利技术属性】
技术研发人员：李锂，马小来，田方方，杜媛媛，杜宏银，刘亚晗，
申请(专利权)人：深圳市海普瑞药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44