硫酸类肝素二糖的制备纯化方法及其纯化产品技术

本发明专利技术涉及一种硫酸类肝素二糖的制备纯化方法及其纯化产品，所述方法是以肝素二糖为原料，经过阳离子交换树脂洗脱，吡啶调节洗脱液的pH至弱酸性，得到肝素吡啶二糖；所述的肝素吡啶二糖分别与1-甲基-2-吡咯烷酮的水溶液，乙酸酐，Na2CO3和硫磺三氧三甲胺联合体反应，反应液经凝胶树脂分离，纯化得到游离氨基二糖，N-乙酰二糖，N-硫酸化二糖。本发明专利技术的纯化方法简单，解决了长期以来特定的二糖结构不能大量制备，制备步骤繁多，并且产品价格昂贵的问题。同时，该问题的解决也将使硫酸类肝素特殊结构和功能之间关系的研究得以进一步开展。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于天然产物制备纯化领域，更具体涉及一种硫酸类肝素二糖的制备和纯化方法及其纯化产品。
技术介绍
硫酸类肝素是由三种不同硫酸化程度的区域交替组成的N-乙酰化区域(NA)是由完全无硫酸化的GlcNAc-GlcUA 二糖单元组成；N-硫酸化区域(NS)是由高度硫酸化的 GlcNS (士6S)-IdoUAQQ 二糖组成，每个二糖有2_3个硫酸基；而N-乙酰化/N-硫酸化区域(NA/NS)是个过渡区域，同时含有无硫和含硫的二糖并且交叉的排列，其序列大致为 GlcNAc-GlcUA-GlCNS-IdoA0硫酸类肝素中存在的12种代表性的二糖结构如图1所示，其中含GlcNAc、GIcNSO3S基的二糖为主要存在形式，而带正电荷的GlcNH3+残基二糖的含量微少。至今为止关于肝素化学修饰的主要文献有houe Y等，使用5%水(或甲醇)/二甲亚砜溶液可选择性地脱除肝素吡啶盐中N位上的硫酸基团；jaseja M等，通过pH=12. 5— 12. 8的NaOH水溶液，a-L-艾杜糖醛酸片段上2S可以定量地脱除；Ayotte L等，使用9:1 的Me2SO-水，Harmo B等使用N-甲基吡咯烷酮水溶液可脱去6S。以上都是基于对长链肝素的修饰。现有的商品化的硫酸类肝素二糖都是由肝素及其衍生物制备得到的。首先通过对完整肝素链的修饰，然后经过肝素酶I、II、111，它们能特异性地裂解肝素链上具有特殊修饰的结构，从而产生不同的寡糖片段。但是这种方法不能制备大量的特定所需的二糖结构， 且制备的步骤繁多，价格比较昂贵。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种硫酸类肝素二糖的纯化方法，通过肝素二糖Hex(2S)-NS(6S)来制备硫酸类肝素中的游离氨基二糖，N-乙酰二糖，N-硫酸化二糖，将促进硫酸类肝素中特殊结构的研究。本专利技术是通过如下技术方案实施的一种硫酸类肝素二糖的制备纯化方法是以肝素二糖为原料，经过阳离子交换树脂洗脱，吡啶调节洗脱液的PH至弱酸性，得到肝素吡啶二糖；所述的肝素吡啶二糖分别与1-甲基-2-吡咯烷酮的水溶液，乙酸酐，Na2CO3和硫磺三氧三甲胺联合体反应，反应液经凝胶树脂分离，纯化得到游离氨基二糖，N-乙酰二糖，N-硫酸化二糖。所述的肝素吡啶二糖的制备方法包括1)在2_5°C中，将肝素二糖水溶液通过阳离子交换树脂，之后再用1-3倍树脂体积的蒸馏水洗脱；2)在室温中，用吡啶将所得的洗脱液在搅拌的状态下，中和至PH为6 6.5 ；3)将中和后的溶液放至在-70°C下冷冻5小时以上，之后在真空冷冻干燥机中冷冻干燥，得到所述的肝素吡啶二糖。所述的游离氨基二糖是通过如下的制备纯化方法1)将肝素吡啶二糖溶于1-甲基-2-吡咯烷酮/水的混合溶液中，在水浴中反应8_12h， 水浴温度为60-70°C，所述的1-甲基-2-吡咯烷酮与水的体积比为8-9 1-2 ；2)将反应后的溶液冷却，加入NaOH溶液，置于一4°C的条件下过夜；3)将过夜后的反应液通过凝胶树脂，以超纯水作为溶剂洗脱，流速为0.5mL/min ；4)将紫外分光光度计检测波长置于232nm处，测量洗脱液的吸光度，收集第一个峰范围的样品，即为游离氨基二糖。所述的肝素吡啶二糖的加入量为l-^ig，所述的1-甲基-2-吡咯烷酮/水的混合溶液的体积为l_3mL ；所述步骤2) NaOH溶液的浓度为0. 05-0. 02mol/L,加入体积为 10-30 μ L0所述的N-乙酰二糖是通过如下方法制备纯化1)将游离氨基二糖加入到PH为7-8的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲体系中，在4°C时恒温反应0. 5-1小时；2)在搅拌下逐渐加入相当于样品两倍摩尔量的乙酸酐，反应10-20分钟；3)将反应液通过凝胶树脂，以超纯水作为溶剂洗脱，流速为0.5mL/min ；4)将紫外分光光度计检测波长置于232nm处，测量洗脱液的吸光度，收集第一个峰范围的样品，即为N-乙酰二糖。所述的NaH2PO4 -Na2HPO4缓冲体系的摩尔浓度为0. 2-0. 3mol/L,添加量为l_3mL， 所述的游离氨基二糖的2-3 mg。所述的N-硫酸化二糖的制备是通过如下纯化方法1)在游离氨基二糖中加入l_3mL超纯水，再加入分别相当于固体样品两倍质量的的 Na2CO3和硫磺三氧三甲胺联合体，在水浴中反应8-12h ；2)将反应后的溶液通过凝胶树脂，以超纯水作为溶剂洗脱，流速为0.5mL/min ；3)将紫外分光光度计检测波长置于232nm处，测量洗脱液的吸光度，收集第一个峰范围的样品，即为N-硫酸化二糖。所述的游离氨基二糖的添加量为2-3 mg。所述的凝胶树脂包括kphadex-G-15树脂柱。所述的纯化产品包括游离氨基二糖，N-乙酰二糖，N-硫酸化二糖。本专利技术的优点为本专利技术的纯化方法简单，解决了长期以来特定的二糖结构不能大量制备，制备步骤繁多，并且产品价格昂贵的问题。同时，该问题的解决也将使硫酸类肝素特殊结构和功能之间关系的研究得以进一步开展。附图说明图1为硫酸类肝素中存在的12种代表性的二糖结构图，其中1，2，7，8为N-乙酰二糖，3，4，5，6为N-硫酸化二糖，9，10，11，12为游离氨基二糖。具体实施例方式1.吡啶二糖的制备(1).根据说明书中树脂的交换量E，计算1克H型阳离子交换树脂(Amberlite IR-120 H型)能交换的钠离子量(mol);⑵.计算交换1克HS 二糖所需树脂量。HS典型二糖分子量约为649，一分子二糖中有 4个钠离子。计算方法如下1 克 HS 二糖含有钠离子的量(mol) (lg/649) x4=0. 0062mol 所需树脂量(g) :0. 0062/E=Y克(3).选取径高比为1比20的玻璃柱。将Y克树脂浸泡在纯水中，反复冲洗直至中性后装柱。(4).将IOOmg的HS 二糖溶解于IOmL蒸馏水，将其与300mL蒸馏水以及填装好的树脂柱放在4°C过夜。⑶在4°C中，将HS 二糖溶液通过H型阳离子交换树脂，之后再用2倍树脂体积的蒸馏水洗。用酸度计所得溶液的PH值。(6)室温中用吡啶将所得溶液中和至PH6 6. 5 (在磁力搅拌下进行)，⑵将溶液转移至-80°C冰箱冷冻5小时以上，之后在真空冷冻干燥机中冷冻干燥。得到硫酸类肝素吡啶二糖固体样品(样品为棕色)。2.游离氨基二糖的制备⑴取2mg的Hex (2S) -NS (6S)-吡啶样品溶于ImL 90%1_甲基-2-吡咯烷酮/水中混勻。 在水浴中反应10h，水浴温度分别为65°C。⑵反应结束后反应液先冷却，然后加入0. IM的NaOH 20 μ L，置于一 4°C冰箱中过夜。⑶将kphadex-G-15树脂浸泡于纯水中，使树脂充分膨胀。将树脂填装于 1. 2x50cm的玻璃层析柱中，其装填量为柱体积的90%。⑷反应液通过kphadex-G-15柱，以超纯水作为溶剂洗脱，流速为0. 5mL/min.数控计滴自动部分收集器收集分离后的反应液.( 紫外分光光度计检测波长置于232nm处，测每根收集管中的溶液吸光度(0D值).以 Y轴为吸光度，X轴为管号做图。收集第一个峰范围的样品，为目标产物游离氨基二糖，第二和第三个峰是反应后的1-甲基-2-吡咯烷酮. 3. N-乙酰化二糖制备(1) 0. 25M PH本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种硫酸类肝素二糖的制备纯化方法，其特征在于：所述方法是以肝素二糖为原料，经过阳离子交换树脂洗脱，吡啶调节洗脱液的ｐＨ至弱酸性，得到肝素吡啶二糖；所述的肝素吡啶二糖分别与１－甲基－２－吡咯烷酮的水溶液，乙酸酐，Ｎａ２ＣＯ３和硫磺三氧三甲胺联合体反应，反应液经凝胶树脂分离，纯化得到游离氨基二糖，Ｎ－乙酰二糖，Ｎ－硫酸化二糖。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：魏峥，林江慧，魏可镁，
申请(专利权)人：福州大学，
类型：发明
国别省市：35