来自Sphingobacterium daejeonense的肝素酶及其制备和应用制造技术

本发明专利技术公开了从Sphingobacterium daejeonense细菌中得到的新型肝素酶SDhepⅠ和SDhepⅡ，为未经过报道的新型肝素酶。酶的获得是通过将筛选得到的细菌发酵培养、粗酶提取、多步柱层析等步骤最终得到。性质研究表明这两种酶在酶解肝素方面具有特异性，有望用于低分子肝素制备或肝素类质量检测方面。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及前未报道过的新型肝素酶，具体而言是涉及来源于Sphingobacterium daejeonense细菌，经过细菌发酵、细胞破碎、多步柱层析分离技术制备出来的两种新型肝素酶SDhepⅠ和SDhepⅡ），以及这两种酶的制备方法及其在肝素和低分子肝素质量检测方面的应用。
技术介绍
肝素酶是指一类能够特异性裂解肝素和类肝素主链糖苷键的酶，其应用十分广泛，如：清除血液中残存肝素、制备低分子肝素、用于肝素结构的研究和质量检测等。肝素酶最初是从肝素黄杆菌中发现并分离出来的，其后又陆续在一些微生物和动物组织中也发现了肝素酶的存在。目前有学术论文报道的肝素酶有10多种，例如Yang V.C.从肝素黄杆菌中发现肝素酶I、II、III，Robert W. Bellamy等人从杆菌属BH100(FERM BP-2613)细菌中发现的产生于胞外的肝素酶，Wan-Seok Kim等人从粪便拟杆菌HJ-15中发现一种肝素裂解酶[Carbohydrate Research,2012,359:37-43]。目前研究和应用最广泛的是来自肝素黄杆菌的肝素酶I、肝素酶II、本文档来自技高网...

【技术保护点】
从Sphingobacterium daejeonense细菌中得到新型肝素酶SDhepⅠ和SDhepⅡ。

【技术特征摘要】
1.从Sphingobacterium daejeonense细菌中得到新型肝素酶SDhepⅠ和SDhepⅡ。
2.根据权利要求1所述的新型肝素酶SDhepⅠ和SDhepⅡ，其特征在于肝素酶SDhepⅠ和SDhepⅡ分子量分别为74692Da和94716Da。
3.根据权利要求1所述的新型肝素酶SDhepⅠ和SDhepⅡ，其特征在于肝素酶SDhepⅠ和SDhepⅡ的等电点分别为5.64和5.76。
4.从Sphingobacterium daejeonense细菌中得到新型肝素酶SDhepⅠ和SDhepⅡ的方法，包括以下步骤：
(1) 将菌种Sphingobacterium daejeonense接种于斜面培养基；
(2) 将步骤(1)所述的菌种接种到种子培养基中，培养1-2天后，接入二级液体种子培养基中，培养1-2天，再接入2L发酵培养基中，培养1-5天，收集细胞；
(3) 将步骤(2)所述的细胞悬浮在Tris-HCl缓冲液中，用高压均质机破碎细胞，离心取上清，冰浴条件下做硫酸铵沉淀,收集饱和度35%-85%的沉淀组分，将沉淀溶解于Tris-HCl缓冲液中，透析；
(4) 将步骤(3)中的酶液上样于一根Tris-HCl缓冲液平衡过的Q柱，再以同样缓冲液平衡，以同样缓冲液中氯化钠0-0.5M线形梯度洗脱，收集上样流出液和平衡液中有酶活组分，为不与Q柱结合的肝素酶SDhepⅠ，同样收集洗脱液中有肝素酶活性的组分，合并透析，为与Q柱结合的肝素酶SDhepⅡ；
(5) 将步骤(4)中的SDhepⅠ上样于Tris-HCl缓冲液平衡过的CS柱，再以同样缓冲液平衡，然后再以同样缓冲液中氯化钠0-0.5M线形梯度洗脱，收集各具有肝素酶活性的组分，透析后上样于Tris-HCl缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡，然后以Tris-HCl缓冲液中氯化钠0-0.5M线形梯度洗脱，收集各活性组分,以截留分子量30kD的超滤离心管浓缩至0.2ml，浓缩的酶液上样于一根用Tris-HCl缓冲液平衡过的Sephadex G-100柱，以同样缓冲液洗脱，收集...

【专利技术属性】
技术研发人员：白佳珂，张紫恒，曲海薇，马小来，李锂，
申请(专利权)人：深圳市海普瑞药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44