一种高表达水溶性肝素酶I融合蛋白及其编码基因制造技术

本发明专利技术涉及一种高表达水溶性肝素酶I融合蛋白及其编码基因，肝素酶I融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；肝素酶I融合蛋白的编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术通过利用pColdTF载体对肝素酶I的表达基因进行改造，增加了一段表达pColdTF蛋白的核苷酸序列，获得了肝素酶I融合蛋白；该肝素酶I融合蛋白的酶活可达64000U/L发酵液，表达量可达320mg/L发酵液，比酶活可达200U/mg。并且该酶还可通过镍柱分离实现该融合蛋白的一步纯化。

【技术实现步骤摘要】
一种高表达水溶性肝素酶I融合蛋白及其编码基因
本专利技术涉及一种高表达水溶性肝素酶I融合蛋白及其编码基因，属于基因工程
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技术介绍
肝素/硫酸乙酰肝素(Heparin/Heparan Sulfate, Hep/HS)两者具有相同的主链结构，是通过20-100个由D-葡糖醛酸/L-艾杜糖醛酸和N-乙酰葡糖胺组成二糖连接而成的直链多糖，糖链中不同部位的羟基(-OH)及N-乙酰葡糖胺2位氨基的乙酰化或硫酸化使Hep/HS的结构变得异常复杂(Castelli et al.2004 ;Casu2005)。H印/HS广泛分布于哺乳动物的细胞表面和胞外基质中，在各种生命过程中起着重要作用，如:调节血管壁功能，凝血，炎症反应和细胞分化等。肝素酶Ofeparinase)是研究H印/HS构效关系的重要工具酶。肝素酶广泛存在于微生物和动物体内，通过选择性切割H印/HS多糖链对H印/HS的降解代谢和生物学功能进行调节。无论微生物还是哺乳动物来源的肝素酶对H印/HS糖链的切割均具有结构选择性。哺乳动物来源的酶是通过对己糖醛酸和葡萄糖胺之间的糖苷键的水解作用来降解糖链的，而微生物来源的肝素酶则是通过β-消除机制对葡萄糖胺和己糖醛酸之间的糖苷键进行切割，在己糖醛酸残基的4、5位碳原子之间形成在232nm有特定紫外吸收的双键。哺乳动物来源的肝素降解酶参与了细胞信号转导，细胞迁移和癌变等各种生理病理过程。而微生物来源的肝素裂解酶则主要是参与微生物对肝素作为碳源的降解利用以及某些病原微生物对宿主的入侵过程。微生物来源的肝素酶由于种类多、酶活高、稳定性好、易于大量表达纯化、生产成本相对较低等优点，在科学研究、工业生产及临床上被广范应用。具有巨大的开发价值(Tripathi CK et al.2012)。三种来自于肝素黄杆菌(Flavobacteriumheparinum)的肝素裂解酶被广泛研究并做为主要的商品化肝素酶被广泛应用，被分别命名为为肝素酶I (Heparinase I)、肝素酶II (Heparinase II)、肝素酶III (Heparinase III)。这三种肝素裂解酶在降解肝素与硫酸乙酰肝素的能力上有差异，肝素酶I主要以降解肝素为主，肝素酶III主要降解硫酸乙酰肝素，肝素酶II既降解肝素也降解硫酸乙酰肝素(Linhardt et al.1987，1990)。这三个酶均为周质空间空间蛋白，早期主要是通过对菌体进行渗透压冲击或超生破碎并结合各种色谱对天然酶蛋白进行分离纯化，天然酶蛋白具有酶活高水溶性好等特点，但存在产量低、操作复杂、纯度难以保证和成本高等问题。自上世纪九十年代初开始，三种来自肝素黄杆菌的肝素酶被先后克隆表达(Godavarti et al.1996 ；Sasisekharan et al.1993 ；Shaya et al.2004)。但是，目前利用 pET表达系统在大肠杆菌中表达肝素酶时，一直存在重组酶水溶性差，易形成包涵体，需要复杂的蛋白复性处理，且复性蛋白不稳定，容易在保存过程中再度沉淀时候等问题。近年来，肝素酶I被广泛克隆到不同的表达载体与宿主中，但是依然面临着表达量低，活性低，水溶性差等问题，因此寻找和建立表达效率高、酶蛋白水溶性好、活力高的肝素酶重组表达技术具有重要的理论和现实意义。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种水溶性好、酶活力高的肝素酶I融合蛋白及其编码基因。一种肝素酶I融合蛋白，氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。一种肝素酶I融合蛋白的编码基因，核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。一种重组表达载体，在表达载体中插入了上述肝素酶I融合蛋白的编码基因。上述表达载体选自大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体。一种重组菌或转基因细胞系，在宿主细胞或细胞系中插入了上述肝素酶I融合蛋白的编码基因。上述宿主细胞或细胞系选自大肠杆菌宿主细胞、酵母菌宿主细胞、枯草杆菌宿主细胞、乳酸菌宿主细胞、放线菌宿主细胞、丝状真菌宿主细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。用于重组表达肝素酶I融合蛋白的重组菌或转基因细胞系，可以是大肠杆菌宿主细胞(如 Escherichia coli BL21> Escherichia coli JM109> Escheri chi a coli DH5 α 等)、酵母菌宿主细胞(如 Saccharomyces cerevisiae>Pichia pastoris>Kluyveromyces Iactis等)、枯草杆菌宿主细胞(如 Bacillus subtilis R25、Bacillus subtilis9920 等)、乳酸菌宿主细胞(如Lactic acid bacteria C0CC101等)、放线菌宿主细胞(如Streptomycesspp.等)、丝状真菌宿主细胞(如 Trichoderma viride, Trichoderma reesei, Aspergillusniger、Aspergillus nidulans 等)、昆虫细胞(如 Bombyxmori, Antharaea eucalypti 等)或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞CH0，幼小仓鼠肾脏细胞BHK、中国仓鼠肺细胞CHL坐')寸/ ο上述编码基因、重组表达载体、重组菌或转基因细胞系在制备肝素酶I融合蛋白中的应用。益效果本专利技术通过利用PColdTF载体对肝素酶I的表达基因进行改造，增加了一段表达PColdTF蛋白的核苷酸序列，获得了肝素酶I融合蛋白；该肝素酶I融合蛋白的酶活可达64000U/L发酵液，表达量可达320mg/L发酵液，比酶活可达200U/mg。并且该酶还可通过镍柱分离实现该融合蛋白的一步纯化。【附图说明】图1为表达载体pColdTF-H印01的构建过程示意图。图2为从肝素黄杆菌中PCR扩增得到的肝素酶I基因电泳图谱。图3为转化子PCR验证电泳图谱。图4为转化子酶切验证电泳图谱。图5重组肝素酶pCoIdTF-1fepOI表达及纯化情况的聚丙烯酰胺凝胶电泳图(SDS-PAGE)；其中:M、蛋白质分子量标准，条带自上至下大小为116kD，66.2kD，45kD，35kD，25kD，18.4kD，14.4kD ;泳道1、对照菌株破壁前菌体，上样量10 μ L，泳道2、重组菌破壁前菌体，上样量10 μ L，泳道3、重组菌破壁后上清，上样量10 μ L，泳道4、经镍柱纯化的HCDase，上样量10 μ Lo图6重组肝素酶pCo IdTF-H印OI降解肝素所得产物的HPLC分析图。【具体实施方式】以下实施例的阐述，是为了全面公开本专利技术如何实施的一些常用技术，而不是为了限制本专利技术的应用范围。专利技术人已经尽最大努力确保实施例中个参数的准确性(例如量，温度，等等)，但是一些实验误差和偏差也应该予以考虑。除非另有说明，本专利技术中分子量是指重均分子量，温度是摄氏度。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。所述引物合成及测序工作均由上海生工生物技术有限公司完成，所有的限制性内切酶及dNTP均购TaKaRa公司；所有感受态细胞(如:本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肝素酶I融合蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种肝素酶I融合蛋白，氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。2.一种肝素酶I融合蛋白的编码基因，核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。3.—种重组表达载体，在表达载体中插入了权利要求2所述肝素酶I融合蛋白的编码基因。4.如权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述表达载体选自大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体或哺乳动物细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：李福川，赵梅，韩文君，王文爽，彭立正，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37