本发明专利技术公开了一种水稻光合作用关键酶——核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)的大亚基抗原表位、抗水稻Rubisco大亚基的多克隆抗体及其制备方法与应用。水稻Rubisco大亚基特异性抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，经过多肽合成，多肽与载体蛋白偶联，免疫动物制得抗血清，并经过亲和层析纯化得到水稻Rubisco大亚基多克隆抗体。本发明专利技术制备的多克隆抗体效价高、亲和力强、特异性好，可与水稻Rubisco大亚基发生特异性结合反应，且制备成本低，得率高，为水稻Rubisco大亚基的基础研究及其相关生理功能的研究提供了一个重要的工具。
【技术实现步骤摘要】
水稻Rubisco大亚基抗原表位、其抗体及应用
本专利技术属于分子生物学和免疫学领域，具体涉及一种水稻光合作用关键酶一核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)的大亚基抗原表位,其抗体及应用。技术背景核酮糖-1，5_二憐酸羧化酶 / 加氧酶(ribulose-l, 5-bisphosphatecarboxylase/oxygenase, Rubisco ；EC4.1.1.39)是植物叶片中含量最丰富的蛋白，占叶片总蛋白的12-35%及可溶性蛋白的50%。Rubisco是具有双重功能的光合碳同化的关键酶，一方面作为光合作用卡尔文循环中CO2固定的关键酶，参与催化CO2与核酮糖-1,5-二憐酸(ribulose-l, 5-bisphosphate, RuBP)反应形成2分子3_憐酸甘油酸(3-phosphoglycerate, 3-PGA);同时又参与C3植物光呼吸过程,催化CO2与RuBP反应生成I分子的3-PGA和I分子的2_憐酸乙醇酸(2-phosphoglycolate, 2-PG)。因此,Rubisco可以作为评价植物光合作用能力的生化指标，研究Rubisco的结构稳定性与降解机理对探索植物光合作用能力和调控作物生长具有重要意义。高等植物的Rubisco对生长环境中的营养供应、光照、温度、病虫害和叶片年龄变化较为敏感，表现为结构上的变化，在不利条件下发生解体，从而降低光合作用功能，影响产量与品质的形成。经研究，在水稻Rubisc0组成的大、小亚基中，大亚基对环境因素反应更为敏感。同一种植物中，不同基因型的Rubisco大亚基的稳定性存在差异，高产品种的Rubisco大亚基结构通常具有较好的稳定性。因此快速准确检测Rubisco大亚基蛋白稳定性水平是了解和评价植物叶片功能稳定性的关键技术。 高等植物Rubisco全酶由8个分子量约55kDa的大亚基(Rubisco large subunit,rbcL)和8个分子量约14kDa的小亚基(Rubisco small subunit,rbcS)聚合而成，分布于叶绿体基质中。其中rbcL由叶绿体基因编码的475个氨基酸残基组成，rbcS由核基因编码的123个氨基酸残基组成；不同物种间rbcL序列同源性高达80%以上，而rbcS同源性不到70%。根据结构-功能学分析，催化所必需的最重要的氨基酸残基位于rbcL上。据此，种间杂交的Rubisco动力学性质应遵循母体遗传(Evans and Austion, 1986)。此外，Whitney等(2011)报道含有C4黄顶菊属rbcL和烟草rbcS的杂交Rubisco表现C4黄顶菊属高活性类型Rubisco的催化性能。这些结果说明Rubisco的催化性能很大程度上取决于rbcL的氨基酸序列。rbcL包括N、B和C三个结构域。N结构域开始于N端的137个氨基酸残基，含有5个β折叠。B和C结构域由α螺旋构成，C端结构域由8个平行的β折叠和8个α螺旋组成的α β桶状结构。α β桶的核心除了两末端的β折叠外，都是疏水残基，Rubisco活性中心呈漏斗状，由rbcL N结构域的2个环和C端结构域α β桶状区域的8个Loop环所提供的大量电子和极性基团所组成，并有Mg2+参与，它和带有氨甲酰基的Lysl91和侧链Aspl93及Glul94三个氨基酸发生作用(Lundqvist et al., 1991)。位于rbcL活性中心附近的氨基酸如(Lys-191, Lys-166, Lys-329)则表现出序列的保守性。关于Rubisco相关研究聚焦在大亚基上,涉及基因表达、蛋白表达和生化活性等方面研究，还有待深入。蛋白质印记技术(Western Blot)是一种用特异性抗体定性定量分析目的蛋白的的蛋白质检测技术，具有灵敏度高、特异性好、操作简便和结果直观等优点。目前，国内外已有制备rbcL抗体合成的报道，依据抗原来源分为三类:一是提取植物Rubisco粗酶液，经硫酸铵分级沉淀纯化后作为抗原，此种最为常见；二是采用纯化后的重组蛋白作为抗原免疫动物；三是经人工合成多肽途径制备抗原，免疫动物而获得抗体，此种鲜有报道。虽然前两种方法对抗原蛋白进行纯化，但由于存在多个潜在抗原决定簇，所制备的抗体特异性无法保证。而经多肽合成单一抗原，具有易操作、准确性高和成本低廉的优点。
技术实现思路
本专利技术通过对水稻Rubisco大亚基(rbcL)进行抗原表位预测并合成相应多肽作为抗原，制备了 rbcL多克隆抗体，该抗体具有较高的灵敏性和特异性。具体地，本专利技术包括以下几方面:本专利技术的第一个目的是提供一种水稻Rubisco大亚基的抗原表位。通过分析水稻Rubisco大亚基 蛋白的特性(亲水性和疏水性)及二级结构，得到多个抗原表位序列，综合考虑多妝的长度等因素，确定了一条最有效的抗原表位，其氣基酸序列为KLTYYTPEYETKDTD (如 SEQ ID NO:1 所示)。本专利技术的第二个目的是提供所述抗原表位的用途。该抗原表位用于制备人工合成多肽抗原以及水稻Rubisco大亚基多克隆抗体。本专利技术的第三个目的提供是一种水稻Rubisco大亚基多克隆抗体的制备方法:首先对所述多肽的氨基酸序列进行末端修饰，然后将修饰后的多肽经过固相合成并与载体蛋白偶联，得到抗原，用抗原免疫动物后，取动物的多抗血清并从中分离纯化多克隆抗体。所述末端修饰为在氨基酸序列的C端增加一个半胱氨酸残基，修饰后的多肽的氨基酸序列为 KLTYYTPEYETKDTDC(如 SEQ ID NO:2 所示)。为增强动物的免疫反应，将多肽与载体蛋白偶联，所述载体蛋白为钥孔戚血兰蛋白(keyhole limpet hemacyanin, KLH),偶联剂为琥拍酰亚胺_4_环已烧-1-碳酸酯(suecinimidyl4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate,SMCC)。将多肽采用9-芴甲氧羰基(FMOC)保护α -氨基进行固相合成。本专利技术的第四个目的是提供一种水稻Rubisco大亚基多克隆抗体。本专利技术所提供的水稻Rubisco大亚基抗体，是用上述抗原免疫动物，再从所免疫的动物中分离、纯化血清得到特异性好、敏感性强的多克隆抗体。免疫动物可以选择兔、小鼠、大鼠、山羊等常用的免疫动物，纯化方法为亲和层析纯化。本专利技术的第五个目的是提供所述多克隆抗体在检测水稻Rubisco大亚基中的应用。所述的多克隆抗体能应用于基于抗原抗体反应原理来检测目的蛋白的生物技术中，包括免疫印迹、免疫共沉淀和免疫组化等应用技术。本专利技术的第六个目的是提供一种检测水稻Rubisco大亚基的方法，该方法包括使用所述的多克隆抗体的步骤。本专利技术的第七个目的是提供一种检测水稻Rubisco大亚基的试剂，该试剂含有所述的多克隆抗体。本专利技术制备的多克隆抗体效价高、亲和力强、特异性好,可与水稻Rubisco大亚基发生特异性结合反应，且制备成本低，得率高，具有工业化生产的可行性。该抗体可对水稻叶片在不同发育时期、不同生长条件下的表达情况进行分析研究，为筛选具有高稳定性Rubisco的种质资源提供了技术支持。【附图说明】图1.多克隆抗体ant1-rbcL纯化前后的特异性检验图2.本专利技术本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种水稻Rubisco大亚基的抗原表位，其多肽的氨基酸序列为SEQ IDNO:1所示。
【技术特征摘要】
1.一种水稻Rubisco大亚基的抗原表位，其多肽的氨基酸序列为SEQ IDNO:1所示。2.权利要求1所述的抗原表位在制备水稻Rubisco大亚基多克隆抗体中的应用。3.—种水稻Rubisco大亚基多克隆抗体的制备方法,其特征在于:首先对权利要求1中所述的多肽的氨基酸序列进行末端修饰，然后将修饰后的多肽经过固相合成并与载体蛋白偶联，得到抗原，用抗原免疫动物后，取动物的多抗血清并从中分离纯化多克隆抗体。4.根据权利要求3所述的多克隆抗体制备方法，其特征在于:所述末端修饰为在权利要求I中所述的氨基酸序列的C端增...
【专利技术属性】
技术研发人员：唐红玲，何莹，李海霞，曾汉来，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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