本发明专利技术属于医药领域涉及一种化学降解肝素及检测肝素二糖组成的方法，包括如下步骤：(1)将肝素脱乙酰化，得脱乙酰肝素；(2)将脱乙酰肝素用亚硝酸降解，得肝素二糖；(3)将肝素二糖用衍生试剂衍生；(4)用液相色谱(LC)法或液相色谱质谱联用(LC-MS)法检测步骤(3)所得衍生后的二糖。本发明专利技术化学降解法可将肝素完全降解为二糖，可以保存全部的糖醛酸信息，能够准确并且完全地得到肝素二糖的结构信息；降解条件温和，成本低，操作简单，对实验仪器要求低，适用范围广，适合多种肝素；检测耗时短，样品消耗量小，灵敏度高，分析结果重复性好。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术属于医药领域涉及，包括如下步骤：(1)将肝素脱乙酰化，得脱乙酰肝素；(2)将脱乙酰肝素用亚硝酸降解，得肝素二糖；(3)将肝素二糖用衍生试剂衍生；(4)用液相色谱(LC)法或液相色谱质谱联用(LC-MS)法检测步骤(3)所得衍生后的二糖。本专利技术化学降解法可将肝素完全降解为二糖，可以保存全部的糖醛酸信息，能够准确并且完全地得到肝素二糖的结构信息；降解条件温和，成本低，操作简单，对实验仪器要求低，适用范围广，适合多种肝素；检测耗时短，样品消耗量小，灵敏度高，分析结果重复性好。【专利说明】—种化学降解肝素及检测肝素二糖组成的方法
本专利技术属于医药领域涉及。
技术介绍
肝素(Heparin)是一种由葡萄糖胺(GlcN)和糖醛酸((D-葡萄糖醛酸(GlcA)或L-艾杜糖醛酸(IdoA))为二糖重复单元组成的线性多糖硫酸脂，肝素分子量范围一般在3-30kDa，平均分子量15kDa。它作为一种抗凝血、抗血栓生成的药物在临床上已经使用了70多年，迄今为止还没有一种能够完全代替肝素的抗凝血和抗血栓生成药物。肝素还具有如抗炎、抗过敏、降血脂及抗动脉粥样硬化、扩张冠脉、缓解支气管筋挛、降低痰液的粘稠性、促进组织呼吸、抑制病毒活性、抗肿瘤转移以及诱导干扰素的产生等许多新的用途与功效。经研究发现，肝素抗凝血机理是通过催化抗凝血因子III (ATIII)、肝素辅助因子II等与多个凝血因子形成共价复合物以消除凝血酶活性来实现的。将肝素通过化学法、物理法或酶解法进一步降解可得到低分子肝素。低分子肝素具可皮下注射、出血可能性低、安全系数高等优点，所以目前低分子肝素是占主导地位的肝素类药物。肝素五糖——磺达肝癸钠，是第一个人工合成的肝素五糖，是目前临床使用的选择性Xa凝血因子抑制剂。我国是肝素的生产大国，提供全世界70%的肝素原料药。2008年发生的污染肝素事件是由肝素钠中混有过硫酸化的类肝素导致的过敏反应引起，因此开发出简单可靠、弓丨领世界的肝素二糖组成分析方法具有重大的理论与实际意义。肝素的结构一般用二糖组成来描叙，其种IdoA2S_GlcNS6S是主要二糖，在猪肠粘膜肝素中这种二糖大约占60-70 %，其他二糖有IdoA2S-GlcNS, IdoA-GlcNS6S,GlcA-GlcNS6S, GlcA_GlcNS3S，GlcA_GlcNS3S6S，GlcA-GlcNAc 等。现分析肝素二糖的传统方法为酶法降解或亚硝酸降解，然后用液相色谱法(LC)或液相色谱质谱联用法(LC-MS)分析，如专利CN201110241617公开了一种用肝素酶1、I1、III降解并用LC法分析依诺肝素。这三种酶具有不同的生物活性，可以切断肝素类样品中不同的糖苷键，将三者联合使用，通过强阴离子交换柱分离酶解得到的各种二糖，与市售的二糖标准品比对保留时间进行定性，再通过各二糖标准品对检测器响应值和物质量的标准曲线进行定量。专利CN200580009444公开了用肝素酶将肝素解聚后用LC分析。但是用酶降解肝素时，葡萄糖醛酸(GlcA)及艾杜糖醛酸(IdoA)脱水后形成结构相同的脱水的糖醛酸，从而失去了肝素中葡萄糖醛酸(GlcA)及艾杜糖醛酸(IdoA)的含量与结构信息，且肝素酶不能将肝素完全降解为二糖。肝素酶、强阴离子交换柱和二糖标准品都非常昂贵，并且酶容易失活，性质不稳定，检测步骤繁琐，样品消耗量大，检测时间长，分析结果的重复性差。用这种方法检测污染肝素，其中的过硫酸软骨素或硫酸皮肤素不仅不能被相应的酶降解，还会抑制肝素酶活性。专利CN200910256076公开了亚硝酸钠降解肝素的方法，亚硝酸降解法只能降解肝素中带有N-硫酸基的葡萄糖胺，不能降解肝素中带有N-乙酰基的葡萄糖胺或过硫酸软骨素或硫酸皮肤素中带有N-乙酰基半乳糖胺，因此只能得到部分二糖的结构信息。因此传统的二糖分析方法已经不能满足现在的需要，因此亟需一种能同时检测肝素及类肝素污染物的二糖组成分析方法。
技术实现思路
针对现有技术存在的不足，本专利技术提供一种全面、高效、简单、稳定且成本低的化学降解肝素及类肝素污染物并检测其二糖组成的方法。实现上述专利技术的技术方案是:1.一种检测肝素二糖组成的方法，包括如下步骤:(I)将肝素脱乙酰化，得脱乙酰肝素；(2)将脱乙酰肝素用亚硝酸降解，得肝素二糖；(3)将肝素二糖用衍生试剂衍生；取步骤(2)所得肝素二糖浓缩至干并完全溶解于水，然后调节pH值至碱性，加入吡唑啉酮类衍生试剂，反应完成后用氯仿萃取三次去除未反应的衍生试剂；(4)用液相色谱(LC)法或液相色谱质谱联用(LC-MS)法检测步骤(3)所得衍生后的二糖。2如权利要求1所述的一种检测肝素二糖组成的方法，步骤(I)所述的脱乙酰化反应步骤包括:将肝素溶于含有N2H4.H2SO4的N2H4.H2O溶液中，加热使其溶解，然后密封加热到93-105 °C，反应2-16h，反应完成后，冻干，除去N2H4得脱乙酰肝素。3.如权利要求1所述的一种检测肝素二糖组成的方法，步骤(I)所述的脱乙酰化反应步骤包括:将肝素溶于含有N2H4.H2SO4的N2H4.H2O溶液中，加热使其溶解，然后密封加热到98 0C,反应4h,反应完成后,冻干，除去N2H4得脱乙酰肝素。4.如权利要求1所述的一种检测肝素二糖组成的方法，步骤(2)所述的亚硝酸降解步骤包括:将脱乙酰肝素浓缩至干，溶于水中，加入pH为1.5的亚硝酸钠水溶液，在0_5°C条件下反应，调节PH到4.0，加入pH为4.0的亚硝酸，在0-5°C条件下反应，加入氨水终止反应，得肝素二糖。本专利技术与现有技术相比具有以下优点:(I)本专利技术方法可将肝素完全降解为二糖，可以保存全部的糖醛酸信息。(2)化学降解条件温和，成本低，操作简单，对实验仪器要求低。(3)适用范围广，适合肝素、原料肝素、低分子量肝素、肝素寡糖以及污染肝素等多种肝素的检测分析。(4)检测耗时短，可以同时对多种样品进行定量。(5)样品消耗量小，灵敏度高，分析结果重复性好，检测限为ng级别。【专利附图】【附图说明】图1为肝素五糖化学降解所得二糖D8PMP衍生的LC图谱。图2为低分子量肝素化学降解所得二糖PMP、D3PMP、D8PMP衍生的总离子流图(A)和质谱图⑶。图3为肝素化学降解所得二糖PMP、D3PMP、D5PMP、D8PMP衍生的总离子流图(A)和质谱图⑶。图4为肝素五糖化学降解所得二糖D3PMP、D5PMP、D8PMP衍生的总离子流图(A)和质谱图⑶。图5为肝素和污染肝素化学降解所得二糖的D3PMP和D8PMP衍生的总离子流图(A)和质谱图⑶。图6为肝素五糖化学降解所得二糖PMP、D3PMP衍生的总离子流图(A)和质谱图⑶。 图7为原料肝素化学降解所得二糖D3NMP衍生的LC图谱。图8为肝素五糖化学降解所得二糖NMP和D3NMP衍生的总离子流图(A)和质谱图⑶。【具体实施方式】实施例1-3肝素购自Sigma-Aldrich公司，产品编号H5515。实例I肝素的化学降解(I)将Img肝素溶于500uL含有10% N2H4.H2SO4的N2H4.H2O溶液中，加热使其溶解，然后密封加热到98°C，反应4小时，反应完成后，冻干，除去N2H4得脱乙酰肝素；(2)将步骤(1)所得脱乙酰肝素溶于5本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测肝素二糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将肝素脱乙酰化，得脱乙酰肝素；(2)将脱乙酰肝素用亚硝酸降解，得肝素二糖；(3)将肝素二糖用衍生试剂衍生取步骤(2)所得肝素二糖浓缩至干并完全溶解于水，然后调节pH值至碱性，加入吡唑啉酮类衍生试剂，反应完成后用氯仿萃取三次去除未反应的衍生试剂；(4)用液相色谱(LC)法或液相色谱质谱联用(LC‑MS)法检测步骤(3)所得衍生后的二糖。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张丽娟，韩章润，曾洋洋，兰莹，邱培菊，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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