本发明专利技术公开了用于果汁中脂环酸芽孢杆菌PCR检测的引物及其应用，本方法主要包括：根据脂环酸芽孢杆菌16S rDNA基因序列的保守区域设计获得特异性引物；建立SYBR Green I荧光定量PCR方法体系；对标准阳性样品进行扩增，建立标准曲线并绘制溶解曲线；果汁样品中脂环酸芽孢杆菌的免疫磁性分离及DNA提取；结果分析与判读。本发明专利技术中建立的荧光定量检测方法可在3小时内完成96个样品的检测，具有快速简单、检测成本低、易于标准化操作且准确性好、灵敏度高的特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于食品微生物检测
，具体设及用于果汁中脂环酸芽抱杆菌PCR 检测的引物及其应用。
技术介绍
脂环酸芽抱杆菌（Ali巧IobacillusSPP.)是一类嗜酸、耐热的革兰氏阳性芽抱杆 菌的统称，杆状、产芽抱，且严格需氧。运类细菌可W生长的抑值范围为2. 0-6. 0,最适抑 值为3. 0-5. 0 ;可W生长的溫度范围为20-60°C，最适生长溫度为45-50°C。由于运类细菌 可W耐受普通的己氏杀菌，可W在低抑值及高溫条件下存活甚至生长，因此运类细菌也称 为"嗜酸耐热菌"。脂环酸芽抱杆菌可W在果汁中生长代谢产生愈创木酪、2,6-二漠苯酪、 2,6-二氯苯酪等物质，使果汁的口感、风味变差并形成白色沉淀或雾状浑浊。因此，脂环酸 芽抱杆菌是果汁产业中关键的质量安全因子之一，对果汁的生产加工及出口贸易构成了严 重威胁。 目前，国际通用的脂环酸芽抱杆菌检测方法依然是培养法，虽然其简单易于操作， 但工作量大、耗时长、检测严重滞后于生产实际。同时，研究开发的常规PCR、化qMan实时巧 光定量PCR、傅里叶变换红外光谱和电子鼻等检测方法主要针对于A.acidoterrestris，且 尚未真正应用于食品工业实际样本的分析。因此，适用于脂环酸芽抱杆菌快速检测的方法 较少，研究建立高效、快速的检测方法，及时识别与发现果汁中脂环酸芽抱杆菌污染，切实 保障果汁品质及质量安全，一直是工业化生产和科研工作者研究的热点。
技术实现思路
针对现有技术中的缺陷和不足，本专利技术设计了一种用于果汁中脂环酸芽抱杆菌 PCR检测的引物，并将其应用在果汁中脂环酸芽抱杆菌的SYBRGreenI巧光定量PCR检测 方法中。 为了实施上述目标，本专利技术采用的主要技术方案如下： 一种用于果汁中脂环酸芽抱杆菌PCR检测的引物，该引物根据脂环酸芽抱杆菌 16SrDNA基因序列的保守区域设计获得，该引物包括上游引物序列SEQIDNO. 1和下游引 物序列沈QIDNO. 2 ; 所述的上游引物序列沈QIDNO. 1 为 5'-ATGCGTAGATATGTGGAGGA-3' ； 所述的下游引物序列沈QIDNO. 2 为 5'-CAGGCGGAGTGCTTATTG-3'。 所述的引物在果汁中脂环酸芽抱杆菌PCR检测中的应用。 具体的，所述的果汁中脂环酸芽抱杆菌PCR检测为果汁中脂环酸芽抱杆菌的SYBR GreenI巧光定量PCR检测。 更具体的，检测方法包括采用免疫磁性分离技术进行果汁样品的预处理，然后利 用权利要求1中的引物进行果汁样品中脂环酸芽抱杆菌的SYBRGreenI巧光定量PCR检 测。 再具体的，所述的SYBRGreenI巧光定量PCR检测方法的模板为脂环酸芽抱杆菌 样品总DNA，SYBRGreenI巧光定量PCR检测方法的反应体系包括无菌超纯水、SYBRGreen IPremixEx-化q?、上游引物序列沈QIDNO. 1、下游引物序列沈QIDNO. 2和脂环酸芽抱 杆菌样品总DNA。 进一步的，所述的反应体系包括 12. 5JiL的SYBRGreenIPremixEx-1'aq?、 0.5化的浓度为IOyM上游引物沈QIDNO. 1、0.5化的浓度为IOyM下游引物沈QID NO. 2、1. 0yL的脂环酸芽抱杆菌样品总DNA和10. 5yL的无菌超纯水。 一种用于果汁中脂环酸芽抱杆菌PCR检测的试剂盒，该试剂盒中含有权利要求1 所述的上游引物序列SEQIDNO. 1和下游引物序列SEQIDNO. 2。 与现有技术相比，本专利技术的优点为： 本专利技术对脂环酸芽抱杆菌中10个不同属共15个种的16SrDNA基因序列进行比 较，并设计了基于脂环酸芽抱杆菌保守区域的引物。通过软件评价和对实际菌株的检测，说 明获得的引物和建立的方法具有非常好的扩增特异性。本专利技术建立的SYBRGreenI巧光 定量PCR检测方法灵敏度高、特异性强，可W简单快速的判断样品中是否含有脂环酸芽抱 杆菌，具有非常广阔的应用前景。【附图说明】 图1是对脂环酸芽抱杆菌进行16SrDNA基因序列分析，在此基础上进行引物设计 (WA.acidoterrestrisDSM-3923为例，其中，一为上游引物FP，和为下游引物RP);[001引图2是SYBRGreenI巧光定量PCR的特异性评价结果图；图2 (A)和图2度）分别 表示不同种菌体的PCR扩增曲线和烙解曲线图； 图3是SYBRGreenI巧光定量PCR灵敏度评价实验中不同浓度菌体的PCR扩增 曲线图； 图4是SYBRGreenI巧光定量PCR灵敏度评价实验中不同浓度菌体的PCR标准 曲线图； 图5是SYBRGreenI巧光定量PCR灵敏度评价实验中不同浓度菌体的烙解曲线 图； 图6是实施例一中果汁和无菌水稀释样品与Ct之间的关系曲线图； W下结合说明书附图和【具体实施方式】对本专利技术做具体说明。【具体实施方式】 本专利技术通过对Alixyclobacillusspp.中A.acidoterrestris值SM-2498、 DSM-3922、DSM-3923、DSM-3924)，A.contaminans(DSM-17975)， A.acidocaldarius值SM-446、DSM-448、DSM-449、DSM-451)，A.fastidiosus值SM-17978)， A.he;rba;rius(^DSM-13609)，A.hespe;ridum(DSM-12489)，A.sendaiensis(DSM-17614)， A.acidi地ilus值SM-14558)和A.pomorum值SM-14955) 10个不同属共15个种脂环酸芽抱杆 菌的16SrDNA序列进行分析设计了特异性引物。所述的引物由上游引物和下游引物组成， 其核巧酸序列如下所示：沈QIDNO. 1 :5,-ATGCGTAGATATGTGGAGGA-3,；沈Q ID NO. 2 :5' -CAGGC GGAGT GCTTA TTG-3，。 其扩增产物的长度为188bp。 本专利技术还提供了一种脂环酸芽抱杆菌检测方法，该方法W样品总DM为模板，利 用核巧酸序列为SEQ ID NO. 1的上游引物和核巧酸序列为SEQ ID NO. 2的下游引物进行 SYBR Green I巧光定量PCR扩增，每个循环结束后采集数据，反应结束后根据扩增曲线和标 准曲线进行脂环酸芽抱杆菌的判读。 本专利技术中对于脂环酸芽抱杆菌的检测是W样品总DNA为模板，进行SYBR Green I 巧光定量PCR反应，反应条件是在反应体系中加入无菌超纯水、2 X SYBR Green I Premix Ex-化q?、上游引物、下游引物和总DM。 具体的，本专利技术中对于脂环酸芽抱杆菌的检测，是在25yL反应体系中进行，反 应条件是加入12. 5yL的SYBRGreenIPremixEx-^qTMiO. 5yL的上游引物沈QID NO. 1 (10yM)，0. 5yL的下游引物沈QIDNO. 2 (10yM)，1. 0yL的DNA模板和 10. 5yL的 備2〇。 更具体的，本专利技术中SYBRGreenI巧光定量PCR的反应条件为：95°C预变性 IOmin;随后95°C条件下变性15s本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于果汁中脂环酸芽孢杆菌PCR检测的引物，其特征在于，该引物根据脂环酸芽孢杆菌16S rDNA基因序列的保守区域设计获得，该引物包括上游引物序列SEQ ID NO.1和下游引物序列SEQ ID NO.2；所述的上游引物序列SEQ ID NO.1为5’‑ATGCG TAGAT ATGTG GAGGA‑3’；所述的下游引物序列SEQ ID NO.2为5’‑CAGGC GGAGT GCTTA TTG‑3’。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王周利，蔡瑞，岳田利，袁亚宏，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。