本发明专利技术公开了一种脂环酸芽孢杆菌的免疫磁性微球及其应用，所公开的脂环酸芽孢杆菌的免疫磁性微球是用胺基化磁性微球包被氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体而得到的；所述氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体的制备方法包括：利用过硫酸钠的PBS溶液对脂环酸芽孢杆菌特异性抗体进行氧化处理，之后收集获得氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体。利用上述公开的脂环酸芽孢杆菌的免疫磁性微球可对果汁尤其是苹果汁中的脂环酸芽孢杆菌进行有效分离。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于食品微生物检测
，具体涉及脂环酸芽孢杆菌的免疫磁性微球及其应用。
技术介绍
脂环酸芽孢杆菌，俗称嗜酸耐热菌，属于革兰氏阳性芽孢杆菌，杆状、产芽孢、严格需氧，可以在pH2.5～6.0，20～60℃广泛温度范围内存活和生长，是苹果及其他果汁中常见的污染菌。由于其具有耐热、耐酸的特性，普通的巴氏杀菌难以将其杀灭。该菌在浓缩果汁中不繁殖，但浓缩果汁稀释成低浓度果汁时，即可代谢产生具有不愉快风味的物质——愈创木酚和2,6-二溴苯酚，使果汁口感、风味变差，形成白色沉淀或雾状浑浊，使苹果汁品质下降。因此，浓缩苹果汁中脂环酸芽孢杆菌的快速检测及控制技术已成为食品工业研究的热点。目前，对于苹果汁中脂环酸芽孢杆菌的控制技术，研究较多的有高温杀灭，欧姆加热法，脉冲电场杀菌，紫外线照射，辐照，超声波及超高压杀灭等。在浓缩苹果汁工业化生产过程中对于脂环酸芽孢杆菌的控制，主要是高温瞬时灭菌和膜过滤。高温处理会对果汁的风味产生一定的影响，而膜过滤方法由于成本高，且使用一定时间后过滤效果下降，需要根据过滤效果周期性的更换滤膜，导致了生产成本的增加。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供脂环酸芽孢杆菌的免疫磁性微球，以实现食品中脂环酸芽孢杆菌的快速分离。为此，本专利技术提供的脂环酸芽孢杆菌的免疫磁性微球是用胺基化磁性微球包被氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体而得到的；所述氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体的制备方法包括：利用含过硫酸钠的PBS缓冲液对脂环酸芽孢杆菌特异性抗体进行氧化处理，之后收集获得氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体。采用Sephadex G-25层析柱收集获得氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体。所述氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体制备方法还包括：所述含过硫酸钠的PBS缓冲液中过硫酸钠浓度为10mg/mL，PBS缓冲液的浓度为0.1mol/L、pH值为7.4；所述脂环酸芽孢杆菌特异性抗体的浓度为（1-3mg）/mL；所述含过硫酸钠的PBS缓冲液与脂环酸芽孢杆菌特异性抗体的体积比为（1-3）：1。所述胺基化磁性微球的制备方法包括：（1）80-90℃条件下，Fe3O4磁核在硅酸钠溶液中进行硅烷化反应制备硅烷化磁性微球；所述硅酸钠溶液的质量浓度为4%-5%、PH大于11；（2）调节硅烷化磁性微球的PH呈中性；（3）80-90℃条件下，将PH呈中性的硅烷化磁性微球、甲醇、3-氨丙基三乙氧基硅烷、去离子水和甘油混合反应制备胺基化磁性微球；所述硅烷化磁性微球、甲醇、3-氨丙基三乙氧基硅烷、去离子水和甘油的用量为：硅烷化磁性微球： （1-2g）/毫升甲醇： 150体积，3-氨丙基三乙氧基硅烷： 10体积，去离子水： 1体积，甘油： 150-161体积。所述的Fe3O4磁核的粒径为15-25nm、磁性的饱和磁化强度为在（40-80emu）/g。所述氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体的浓度为（1-2mg）/毫升，且每毫升氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体用20mg的胺基化磁性微球包被。进一步地，利用封闭液封闭所述的脂环酸芽孢杆菌的免疫磁性微球，所述封闭液的组分量为：每100ml PBS中含有1-10克BSA和0.05ml Tween-20。本专利技术提供脂环酸芽孢杆菌的免疫磁微球优点在于：（1）本专利技术中的胺基化磁性微球具有特异性结合位点，可以实现对抗体的高效及特异性固定化，有效保留了抗体-抗原反应结合位点。（2）本专利技术的脂环酸芽孢杆菌特异性抗体氧化处理方法中抗体的Fc区域的糖链羟基部分被氧化为醛基，且保留了抗体的识别位点；处理后的抗体可与磁性微球的胺基部分高效结合，并保留了抗体的Fab活性区域，保证对目标菌体的有效识别和分离。（3）本专利技术的制备方法中抗体有效结合到磁性微球表面，并保留了对脂环酸芽孢杆菌高度特异性分离和富集特性。尤其是经封闭处理后的免疫磁性微球可实现脂环酸芽孢杆菌的有效分离。（4）采用本专利技术的胺基化磁性微球的制备方法制备的胺基化磁性微球的粒径为45-55nm、磁性的饱和磁化强为（40-60emu）/g。本专利技术的另一目的是将上述脂环酸芽孢杆菌的免疫磁性微球用于分离果汁中的脂环酸芽孢杆菌的应用。所述的果汁中的可溶性固形物含量≤15°Brix。利用本专利技术的脂环酸芽孢杆菌的免疫磁性微球分离果汁中的脂环酸芽孢杆菌时，无需特殊试剂和样品前处理，即可实现检测样品中目标菌体的分离和富集，且速度快、成本低、效果好。附图说明图1为磁性微球的APTES胺基化改性及制备图；图2为免疫磁性微球的制备流程图；图3为不同浓度BSA封闭对免疫磁性微球特异性吸附影响（以Fe3O4磁核吸附抗体获得的免疫磁珠为对照），该图的横坐标为：封闭液中BSA的质量浓度，纵坐标为菌体分离率；图4为不同浓度脂环酸芽孢杆菌标准菌株免疫磁分离效果图，该图的横坐标为菌体浓度，纵坐标为菌体分离率。具体实施方式利用免疫磁性微球对食品中相应菌体分离与富集的原理是在分离过程中，特异性抗体与目标抗原结合形成抗原-微球复合物，在磁力作用下，该复合物发生力学移动，从而达到抗原分离与富集的目的。结合图1和图2，本专利技术对脂环酸芽孢杆菌特异性抗体进行氧化处理，将抗体可结晶段（Fc区域）糖链部分转化成醛基，并以APTES胺基化处理的磁性微球为载体，实现了脂环酸芽孢杆菌特异性抗体的定向固定化。通过这种方式，可以使抗体与磁性微球的结合位点远离抗原结合区，从而最大程度保留了抗体的活性位点。本专利技术使用的脂环酸芽孢杆菌特异性抗体为文献Zhouli Wang,Tianli Yue,Yahong Yuan,et al.Development of Polyclonal Antibody-Based Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for the Detection of Alicyclobacillus Strains in Apple Juice.Journal of food science,2012,77:M643-M649中公开的脂环酸芽孢杆菌特异性抗体。具体是将脂环酸芽孢杆菌标准菌株活化，摇瓶培养，取培养18～24h的新鲜菌液，充分、离心后倒掉上清液，加入适量生理盐水，使菌体重新悬本文档来自技高网...
【技术保护点】
脂环酸芽孢杆菌的免疫磁性微球，其特征在于，该脂环酸芽孢杆菌的免疫磁性微球是用胺基化磁性微球包被氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体而得到的；所述氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体的制备方法包括：利用含过硫酸钠的PBS缓冲液对脂环酸芽孢杆菌特异性抗体进行氧化处理，之后收集获得氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体。
【技术特征摘要】
1.脂环酸芽孢杆菌的免疫磁性微球，其特征在于，该脂环酸芽孢杆菌的
免疫磁性微球是用胺基化磁性微球包被氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体而得
到的；所述氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体的制备方法包括：利用含过硫酸钠
的PBS缓冲液对脂环酸芽孢杆菌特异性抗体进行氧化处理，之后收集获得氧化
脂环酸芽孢杆菌特异性抗体。
2.如权利要求1所述的脂环酸芽孢杆菌的免疫磁性微球，其特征在于，
采用Sephadex G-25层析柱收集获得氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体。
3.如权利要求1所述的脂环酸芽孢杆菌的免疫磁性微球，其特征在于，
所述氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体制备方法还包括：
所述含过硫酸钠的PBS缓冲液中过硫酸钠浓度为10mg/mL，PBS缓冲液
的浓度为0.1mol/L、pH值为7.4；
所述脂环酸芽孢杆菌特异性抗体的浓度为（1-3mg）/mL；所述含过硫酸
钠的PBS缓冲液与脂环酸芽孢杆菌特异性抗体的体积比为（1-3）：1。
4.如权利要求1所述的脂环酸芽孢杆菌的免疫磁性微球，其特征在于，
所述胺基化磁性微球的制备方法包括：
（1）80-90℃条件下，Fe3O4磁核在硅酸钠溶液中进行硅烷化反应制备硅
烷化磁性微球；所述硅酸钠溶液的质量浓度为4%-5%、PH大于11；
（2）调节硅烷化磁性微球的PH呈中性；
（3）80-90℃条件下，将PH呈中性的硅烷化磁性微球、甲醇、3-氨丙基
\t三乙氧基硅烷、去离子水和甘油混合反应制备胺基化磁性微球；所述硅烷化磁
【专利技术属性】
技术研发人员：岳田利，王周利，袁亚宏，蔡瑞，牛晨，郭彩霞，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：
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