本发明专利技术公开一种通过点突变提高大片段嗜热脂肪地芽孢杆菌DNA聚合酶活性的方法及应用，属于基因工程领域的基因重组表达技术领域。酶的基因来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)。通过基因重组获得大片段Bst DNA聚合酶质粒。将大片段Bst DNA聚合酶的第310位氨基酸G突变为L或A，或将510位氨基酸D突变为E，突变位点氨基酸均为保守氨基酸。结果显示与野生型Bst DNA聚合酶相比，突变体G310L、G310A和D540E的聚合效率均有显著提高，且都高于商业化Bst DNA聚合酶，具有较大的应用价值，为Bst DNA聚合酶国产化提供便利。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域的基因重组表达
，具体涉及一种通过点突变提高大片段嗜热脂肪地芽孢杆菌DNA聚合酶(BstDNA聚合酶)活性的方法及应用。
技术介绍
核酸扩增技术广泛应用于医学研究的各个领域，特别是传染病病原的检测，近年来以等温扩增为代表的新方法因检测简单、快速以及高特异性高灵敏性，具有更为广泛的的应用价值。(TsugunoriNotomi,HarumiMasubuchi,ToshhihiroYonekawaetal.,“Loop-mediatedisothermalamplificationofDNA,”NucleicAcidsResearch,vol,28,No.12,2000)。IsothermalMultiple-Self-Matching-InitiatedAmplification(IMSA)等温扩增是Loop-mediatedisothermalamplification(LAMP)等温扩增基础上发展起来的另一种新型等温扩增方法，与之相比具有更高的灵敏度，检测限更低等优点(XiongDing,KaiNie,LeiShi,XuejunMa,“ImprovedDetectionLimitinRapidDetectionofHumanEnterovirus71andCoxsackievirusA16byaNovelReverseTranscription–IsothermalMultiple-Self-Matching-InitiatedAmplificationAssay,”JournalofClinicalMicrobiology,vol.52,no.6,pp.1862–1870,2014)，因此本专利技术所涉及的等温扩增方法均选择IMSA。等温扩增依赖于BstDNA聚合酶，其属于I型DNA聚合酶，来源于嗜热脂肪芽孢杆菌属，完整序列包含三种活性(i):5′-3′外切酶活性(ii)5′-3′聚合酶活性(iii)3′-5′外切酶活性，与其他DNA聚合酶相比，BstDNA聚合酶有着较强的热稳定性、链置换活性及聚合酶活性，因此吸引了越来越多的人的研究兴趣(Seng-MengPhang,Chai-YawTeo,VictorWongThiWong,etal.,“CloningandcompletesequenceoftheDNApolymerase-encodinggene(BstpolⅠ)andcharacterisationoftheKleow-likefragmentfromBacillusstearothermophilus,”Gene,vol.163,pp.65-68,1995)。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的首要目的在于提供一种通过点突变提高大片段嗜热脂肪地芽孢杆菌DNA聚合酶活性的方法。酶的基因来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)GIM1.543(购自中国工业微生物菌种保藏中心)。通过基因重组获得大片段BstDNA聚合酶质粒。将大片段BstDNA聚合酶的第310位氨基酸G突变为L或A，或将510位氨基酸D突变为E，突变位点氨基酸均为保守氨基酸。结果显示与野生型BstDNA聚合酶相比，突变体G310L、G310A和D540E的聚合效率均有显著提高，且都高于商业化BstDNA聚合酶，具有较大的应用价值。本专利技术的另一目的在于提供一种定量检测BstDNA聚合酶聚合效率的方法。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种通过点突变提高大片段嗜热脂肪地芽孢杆菌DNA聚合酶活性的方法，是通过酶切连接将野生型BstDNA聚合酶基因克隆到原核表达载体上，并通过RF克隆技术对氨基酸G310或D540进行点突变构建突变体，并转入原核表达载体进行表达，纯化，并进行酶活检测；所述的野生型BstDNA聚合酶的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。编码野生型BstDNA聚合酶的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。所述的突变体为G310L、G310A或D540E。所述的突变体G310L的氨基酸序列如SEQIDNO：3所示。所述的突变体G310L的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示。所述的突变体G310A的氨基酸序列如SEQIDNO：5所示。所述的突变体G310A的核苷酸序列如SEQIDNO：6所示。所述的突变体D540E的氨基酸序列如SEQIDNO：7所示。所述的突变体D540E的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示。所述的原核表达载体优选为pET28a；所述的突变体的具体获得步骤如下：以野生型pET28a-Bst质粒为模板，设计突变引物，通过RF克隆，经核酸扩增及DpnⅠ酶消化后，转化。所述的纯化是镍柱亲和层析方法进行纯化。一种定量检测BstDNA聚合酶聚合效率的方法，是用HPLC方法检测等温扩增反应前后dCTP的减少量，继而计算酶或突变体的Kcat。Kcat值越大，表明聚合效率越高，其酶活性越高。在本专利技术的一种实施方案中，IMSA等温扩增方法用到的模板为手足口病EV71病毒的VP1基因。所述的通过点突变提高大片段嗜热脂肪地芽孢杆菌DNA聚合酶活性的方法在提高大片段嗜热脂肪地芽孢杆菌DNA聚合酶活性中的应用。所述的定量检测BstDNA聚合酶聚合效率的方法在定量检测BstDNA聚合酶聚合效率中的应用。本专利技术的机理是：本研究从嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)GIM1.543中获得BstDNA聚合酶基因组，并对BstDNA聚合酶进行克隆，表达，纯化及定向改造，以满足不断增长的市场需要。大片段BstDNA聚合酶具有5′-3′聚合酶活性，无5′-3′外切酶活性，热稳定性高，链置换活性好等优点。本专利技术相对于现有技术，具有如下的优点及效果：(1)由于专利保护制度严谨，BstDNA聚合酶目前仅有NEWENGLANDBioLabs公司有售，且价格比普通的聚合酶都要昂贵，国内却鲜少有公司出售。因此我们在实验室自主研发大片段BsDNA聚合酶。(2)在大片段BstDNA聚合酶基础上对G310L(A)和D540E两个位点进行点突变，与野生型BstDNA聚合酶相比，G310L和G310A的突变体聚合效率都有所提高，且都高于商业化BstDNA聚合酶，而D540E与野生型聚合效率略有改变。说明G310L，G310A和D540E的突变体聚合效率显著高于野生型BstDNA聚合酶，远高于商业化BstDNA聚合酶。本专利技术通过点突变提高BstDNA聚合酶活性，为科研及实际检测提供更高效率的BstDNA聚合酶，应用价值明显。(3)本专利技术运用高效液相(HPLC)方法定量检测IMSA等温扩增方法消耗的dCTP。(4)本专利技术提供一种快捷简便的方法表达BstDNA聚合酶，并使其与商业化的BstDNA聚合酶有更快的聚合速率，为BstDNA聚合酶国产化提供便利。附图说明图1是大片段pET28a-Bst重组质粒构建图；其中，(a)泳道M：DNAMarker，泳道1：基因组PCR图；(b)泳道M：DNAMarker，泳道1：重组质粒双酶切。图2是WT大片段BstDNA聚合酶表达的SDS-PAGE鉴定；其中，泳道M：proteinMarker，泳道1本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种通过点突变提高大片段嗜热脂肪地芽孢杆菌DNA聚合酶活性的方法，其特征在于是通过酶切连接将野生型Bst DNA聚合酶基因克隆到原核表达载体上，并通过RF克隆技术对氨基酸G310或D540进行点突变构建突变体，并转入原核表达载体进行表达，纯化；所述的野生型Bst DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述的突变体为G310L、G310A或D540E。
【技术特征摘要】
1.一种通过点突变提高大片段嗜热脂肪地芽孢杆菌DNA聚合酶活性的方法，其特征在于是通过酶切连接将野生型BstDNA聚合酶基因克隆到原核表达载体上，并通过RF克隆技术对氨基酸G310或D540进行点突变构建突变体，并转入原核表达载体进行表达，纯化；所述的野生型BstDNA聚合酶的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示；所述的突变体为G310L、G310A或D540E。2.根据权利要求1所述的通过点突变提高大片段嗜热脂肪地芽孢杆菌DNA聚合酶活性的方法，其特征在于：编码野生型BstDNA聚合酶的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。3.根据权利要求1所述的通过点突变提高大片段嗜热脂肪地芽孢杆菌DNA聚合酶活性的方法，其特征在于：所述的突变体G310L的氨基酸序列如SEQIDNO：3所示；所述的突变体G310A的氨基酸序列如SEQIDNO：5所示；所述的突变体D540E的氨基酸序列如SEQIDNO：7所示。4.根据权利要求3所述的通过点突变提高大片段嗜热脂肪地芽孢杆菌DNA聚合酶活性的方...
【专利技术属性】
技术研发人员：李彬，王菊芳，马毅，张蓓蕾，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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