【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种有效制备果树高分子量DNA的方法。
技术介绍
高纯度、高质量的大分子量（HMW）DNA是复杂基因组限制性酶酶切分析和大片段基因组文库构建的前提。植物（HMW）DNA可以从原生质体和细胞核中制备。用原生质体法能制备很少被剪切的高质量（HMW）DNA，但是该方法涉及到一系列降解细胞壁、分离、包埋和裂解等复杂、昂贵、耗时的过程，往往一种优化的方法仅对某种特殊植物材料有效，而且从原生质体中制备的（HMW）DNA有相对高的叶绿体和线粒体DNA的污染，这不仅影响到用于所建基因文库的真实性，而且影响到随后的染色体步查及基因组分析结果的可靠性。国外有研究团队首先从包埋于琼脂糖中的植物细胞核中分离（HMW）DNA，经过改进，此法对许多植物材料都有效，且得到的（HMW）DNA浓度高，叶绿体DNA污染少。但是在制备核和随后裂解过程，造成相对严重的DNA降解。Fu简化了植物细胞核的制备步骤，而通过脉冲电泳（PFGE）来回收粗提核裂解物中的（HMW）DNA，得到了无叶绿体、线粒体DNA污染、非特异小片段含量相对低的高质量（HMW）DNA。对大多数果树，很难分离原生质体，虽然能从组培细胞中分离，但组培过程慢，费事且易造成体细胞变异。因此，大多采用从核中制备果树（HMW）DNA2。由于大多数果树叶片富含多酚多糖类物质，它们会给（HMW）DNA的制备及随后的分析带来很大麻烦，同时在去除多酚和多糖的纯化过程中，往往会影响了核DNA的完整性，因而影响到所建大片段基因文库的真实性。
技术实现思路
本专利技术提出一种有效制备果树高分子量DNA的方法。一种有效制备果树高分子量DNA...
【技术保护点】
一种有效制备果树高分子量DNA的方法，其特征在于包括以下制备步骤：（1）取苹果或桃或杏或樱桃或柿的鲜叶；核提取缓冲液；（2）将10g鲜叶在液氮中研成细粉，加入200ml核提取缓冲液，置于冰浴中，用磁力搅拌器搅拌l0分钟；该匀浆经两层纱布过后，以3000转/分钟的速度，离心20分钟；（3）弃上清，将沉淀物中加入少量核洗涤缓冲液，用毛刷轻轻打散，再加入约200ml核洗涤缓冲液混匀，以60转/分钟的速度，离心5分钟，弃沉淀；（4）将上清液于2000转/分钟的速度下离心20分钟；（5）将该沉淀洗涤l‑3次，用lml lHB（无β‑mercaptoet hanol ）将粗提核混匀，于45 C 下，与等量的l % LMP 琼脂糖混合均匀；（6）将步骤（5）产物装入凝胶块模具中，在4摄氏度温度下凝固l小时，将包埋有细胞核的凝胶块推入20倍体积的核裂解缓冲液中，50摄氏度下裂解24小时，其间更换裂解液两次；（7）将步骤（6）产物在4摄氏度下保存于0.5mol/L EDTA，lm mol／L PSMF 中；（8）将上述凝胶块置于大量的0.5xTBE中透析两小时，然后包埋于l % 琼脂糖凝胶的加样孔中，进...
【技术特征摘要】
1.一种有效制备果树高分子量DNA的方法，其特征在于包括以下制备步骤：（1）取苹果或桃或杏或樱桃或柿的鲜叶；核提取缓冲液；（2）将10g鲜叶在液氮中研成细粉，加入200ml核提取缓冲液，置于冰浴中，用磁力搅拌器搅拌l0分钟；该匀浆经两层纱布过后，以3000转/分钟的速度，离心20分钟；（3）弃上清，将沉淀物中加入少量核洗涤缓冲液，用毛刷轻轻打散，再加入约200ml核洗涤缓冲液混匀，以60转/分钟的速度，离心5分钟，弃沉淀；（4）将上清液于2000转/分钟的速度下离心20分钟；（5）将该沉淀洗涤l-3次，用lmllHB（无β-mercaptoethanol）将粗提核混匀，于45C下，与等量的l%LMP琼脂糖混合均匀；（6）将步骤（5）产物装入凝胶块模具中，在4摄氏度温度下凝固l小时，...
【专利技术属性】
技术研发人员：王耀斌，
申请(专利权)人：陕西高新实业有限公司，
类型：发明
国别省市：陕西;61
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