一种表达嗜热木聚糖酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法技术

一种表达嗜热木聚糖酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，涉及一种微生物重组菌的构建方法。首先根据波曲热多孢菌的内切-1,4-β-木聚糖酶基因设计了引物，PCR扩增成功后进行酶切消化，连接载体质粒pHT43，经大肠杆菌DH5α扩增后，挑选阳性克隆，经菌体PCR及测序验证后，将基因序列测序正确的质粒大量抽提，经过转化导入枯草芽孢杆菌WB800N宿主，培养并经过1mMIPTG诱导表达后，发酵液上清经SDS-PAGE电泳证明嗜热内切-1,4-β-木聚糖酶的重组蛋白成功获得表达。所述重组蛋白的相对分子量为27KD，最适反应温度为80℃，最适反应pH为6.0。所述嗜热内切-1,4-β-木聚糖酶在造纸业和食品加工业中有广泛应用。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种表达嗜热木聚糖酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于包括以下步骤：以波曲热多孢菌基因组为模板，采用Phusion高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，引物：P1: 5′‑ CAACACTCTAGAATGGATACAACAATCACACA‑3′P2: 5′‑ ATCATTCCCGGGTCAAAGTGTAGCAACGC‑3′反应条件为：98 ℃预变性30 s；（98 ℃变性10 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环）；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存;使用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物；2）将上述PCR扩增产物与枯草表达载体pHT43分别使用Xba I和Sma I双酶切后，回收产物经T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α感受态，通过100 µg/mL氨苄青霉素抗性筛选重组质粒，PCR鉴定阳性克隆并测序;3）枯草芽孢杆菌WB800N菌株划线于LB培养基中，37 ℃过夜培养，挑取单菌落于5 mL SPC液体培养基中，37 ℃，200 rpm过夜培养；4）次日，取1 mL过夜培养物转接至8 mL SPC培养基中，37 ℃，200 rpm继续培养，当培养物生长到OD600=1.2～1.6时，按1:1的比例转接到SPII培养基中，37 ℃ 200 rpm继续培养2小时，然后快速把培养物转移到冰上，加入终浓度为10%的甘油，分装成每管0.5 mL，于‑80 ℃保存;5）取4 µL待转化的质粒加入到枯草芽孢杆菌感受态细胞中，于37 ℃ 200 rpm复苏30 min，向复苏的细胞中添加0.3 mL LB液体培养基，继续在相同条件下培养30 min，把培养物在2500 rpm离心1 min，适当浓缩后把转化产物涂布于5 µg/mL LB平板37 ℃过夜培养;6）接种重组枯草芽孢杆菌于2瓶50 mL 2×YT培养基中（一瓶含5 µg/mL Kmr，另一瓶无抗性），37 ℃，200 rpm过夜培养；7）次日，将过夜的菌液转接到新的2×YT培养基中，测得起始OD600约为0.15，37 ℃，200 rpm继续培养，当培养至OD600= 0.7～0.8时，分装为2瓶，一瓶用1 mM IPTG诱导，另一瓶作为对照，不加诱导剂，分别收集1、2、3 h的菌体1 ml，12000 rpm，4 ℃离心10 min，取上清；8）培养基上清液经TCA‑DOC沉淀、丙酮清洗后，用40 µL 的50 mM Tris HCl pH 8.0溶解，加入10 µL 的5×SDS 上样缓冲液经100 ℃加热处理后，采用10% SDS‑PAGE分析培养基中蛋白表达情况;10）取适当稀释酶液于50～100 ℃水浴进行酶解反应，每隔10 ℃测定酶活，以酶活力最高者为100%，作温度‑相对酶活性曲线；11）在80 ℃下，分别测定重组嗜热内切‑1, 4‑β‑木聚糖酶在不同pH值下的酶活性，以测得最大值为100%，作pH‑相对酶活性曲线。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王磊，刘珺，原素英，郑春阳，
申请(专利权)人：天津强微特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12