一种好氧合成维生素B12的大肠杆菌及其构建与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种好氧合成维生素B12的大肠杆菌及其构建与应用，属于代谢工程和微生物发酵领域。本发明专利技术大肠杆菌为宿主细胞，使用兼容的表达载体，将来源于类球红细菌和恶臭假单胞菌维生素B12合成途径中大肠杆菌基因组缺失的基因进行模块化组装并表达，构建重组大肠杆菌工程菌株，通过发酵验证，实现了大肠杆菌合成维生素B12。

【技术实现步骤摘要】
一种好氧合成维生素B12的大肠杆菌及其构建与应用
本专利技术涉及一种好氧合成维生素B12的大肠杆菌及其构建与应用，属于代谢工程和微生物发酵领域。
技术介绍
维生素B12(VitaminB12,VB12)，又称为钴胺素，分子式为C63H88CoN14O14P，分子量是1355.38。它是一类含有钴的咕啉类化合物的总称，是目前已发现的最大、最复杂的维生素分子，也是唯一含有金属离子的维生素；其结晶为红色，故又称红色维生素。1956年，Hodgkin等通过X-射线法证明了其晶体结构，即中心咕啉环、中心环轴向Coβ配基部分及1个含有核苷酸环的Coα配基，结构十分复杂。维生素B12作为一种重要的维生素，其主要生理功能是参与制造骨髓红细胞，防止恶性贫血；防止大脑神经受到破坏。目前，已广泛应用于饲料、食品、医药卫生和化妆品等领域。1972年，美国科学家Woodward,R.B.领导100多位合作者历时11年，共同完成了维生素B12的全化学合成。但由于其化学合成步骤多，收率极低，因此化学合成十分昂贵。早期，人们从动物肝脏、肾脏等组织提取维生素B12，但收率和效益也十分低下。后来，从链霉素发酵废液中提取，收率仍然很低。目前，工业生产中维生素B12的生产主要采用微生物发酵法。自然界中，维生素B12从头合成途径分为两条途径，一条是厌氧合成途径，存在于费氏丙酸杆菌(Propionibacteriumfreudenreichi)、谢氏丙酸杆菌(Propionibacteriumshermanii)、沙门氏菌属(Salmonellasp.)和巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)等细菌中；另一条是好氧合成途径，主要存在于脱氮假单胞菌(Pseudomonasdenitrificans)(好氧菌株)和类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)(兼性好氧菌株)中。目前，用于工业维生素B12发酵的菌株主要是P.shermanii和P.denitrificans。培养基以葡萄糖为主要碳源，玉米浆为主要氮源，补加钴离子及前体5,6-二甲基苯丙咪唑(DMBI)。近年来，由于好氧发酵菌株具有诸多优点，如生长快、培养条件较为简单以及发酵易控制等。好氧发酵工艺是目前工业化生产维生素B12的主要工艺，全球80％以上的产量来自该工艺，以P.denitrificans为生产菌株，培养基采用甜菜糖蜜或麦芽糖为主要碳源，玉米浆或酵母膏为氮源，补加无机盐、钴离子以及DMBI。目前，国内外相关学者将注意力放在通过优化P.denitrificans的发酵工艺，以期提高维生素B12的产量。本专利技术在大肠杆菌中表达来源于类球红细菌和恶臭假单胞菌维生素B12合成途径的基因，采用不同拷贝数的表达载体对基因进行模块化组装，构建维生素B12的从头好氧合成途径大肠杆菌工程菌株。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种好氧合成维生素B12的大肠杆菌工程菌株，是在大肠杆菌中采用不同拷贝数的载体模块化组装表达来源于类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)和恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)的维生素B12合成途径的基因，构建以葡萄糖为底物从头好氧合成维生素B12的途径。所述维生素B12合成途径的基因包括cobA，cobI，cobG，cobJ，cobM，cobF，cobK，cobL，cobH，cobB，cobN，cobS，cobT，cobR，cobO，cobQ，cobC及cobD。在本专利技术的一种实施方式中，所述维生素B12合成途径的基因cobA，cobI，cobJ，cobM，cobF，cobK，cobL，cobH，cobB，cobN，cobS，cobT，cobO，cobQ，cobC和cobD来源于类球红细菌，cobG和cobR来源于恶臭假单胞菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述cobA的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，cobI的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，cobG的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，cobJ的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，cobM的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，cobF的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示，cobK的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示，cobL的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示，cobH的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示，cobB的核苷酸序列如SEQIDNO.10所示，cobN的核苷酸序列如SEQIDNO.11所示，cobS的核苷酸序列如SEQIDNO.12所示，cobT的核苷酸序列如SEQIDNO.13所示，cobR的核苷酸序列如SEQIDNO.14所示，cobO的核苷酸序列如SEQIDNO.15所示，cobQ的核苷酸序列如SEQIDNO.16所示，cobC的核苷酸序列如SEQIDNO.17所示，cobD的核苷酸序列如SEQIDNO.18所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述大肠杆菌宿主包括DH5α、JM109、W3110、BL21(DE3)、MG1655。在本专利技术的一种实施方式中，所述大肠杆菌为BL21(DE3)。所述不同拷贝数表达载体分别为pACYCDuet-1、pCDFDuet-1、pETDuet-1和pRSFDuet-1。在本专利技术的一种实施方式中，以pACYCDuet-1表达cobA、cobI、cobG、cobJ和cobM，pCDFDuet-1表达cobF、cobK、cobL、cobH和cobB，pETDuet-1表达cobN、cobS和cobT，pRSFDuet-1表达cobR、cobO、cobQ、cobC和cobD。在本专利技术的一种实施方式中，在每个单独组装的基因模块前面，添加PgapA启动子和核糖体结合位点。在本专利技术的一种实施方式中，使用pMD19为载体、同尾酶对基因进行组装。在本专利技术的一种实施方式中，所述大肠杆菌工程菌株的构建方法主要包括以下步骤：(1)分别将PgapA和cobM，cobJ和cobG，cobI和cobA通过融合PCR方法连接，组装为PgapA-cobM，cobJG，cobIA。然后以pMD19为载体，利用同尾酶SpeI和XbaI以及BamHI和BglII将3个片段连接，构建质粒pMD19-PgapA-cobMJGIA。最后利用酶切位点AvrII和KpnI与经相同酶切的质粒pACYCDuet-1连接，构建质粒pACYCDuet-1-PgapA-cobMJGIA。(2)分别将PgapA和cobB，cobH和cobL，cobK和cobF通过融合PCR方法连接，组装为PgapA-cobB，cobHL，cobKF。然后以pMD19为载体，利用同尾酶NsiI和PstI以及SpeI和XbaI将3个片段连接，构建质粒pMD19-PgapA-cobBHLKF。最后利用酶切位点AvrII和KpnI与经相同酶切的质粒pCDFDuet-1连接，构建质粒pCDFDuet-1-PgapA-cobBHLKF。(3)分别将PgapA和cobN，cobS和cobT通过融合PCR方法连接，组装为PgapA-cobN，cobST。然后以pMD19为载体，利用同尾酶SpeI和XbaI将2个片段连接，构建质粒pMD19-PgapA-cobNST。最后利用酶切位点Avr本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种好氧合成维生素B12的大肠杆菌工程菌株，其特征在于，是在大肠杆菌中采用不同拷贝数的载体模块化组装表达来源于类球红细菌和恶臭假单胞菌的维生素B12合成途径的基因，构建以葡萄糖为底物好氧合成维生素B12的途径。

【技术特征摘要】
1.一种好氧合成维生素B12的大肠杆菌工程菌株，其特征在于，是在大肠杆菌中采用不同拷贝数的载体模块化组装表达来源于类球红细菌和恶臭假单胞菌的维生素B12合成途径的基因，构建以葡萄糖为底物好氧合成维生素B12的途径；所述维生素B12合成途径的基因包括cobA、cobI、cobG、cobJ、cobM、cobF、cobK、cobL、cobH、cobB、cobN、cobS、cobT、cobR、cobO、cobQ、cobC及cobD；所述cobA的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，cobI的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，cobG的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，cobJ的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，cobM的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，cobF的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示，cobK的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示，cobL的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示，cobH的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示，cobB的核苷酸序列如SEQIDNO.10所示，cobN的核苷酸序列如SEQIDNO.11所示，cobS的核苷酸序列如SEQIDNO.12所示，cobT的核苷酸序列如SEQIDNO.13所示，cobR的核苷酸序列如SEQIDNO.14所示，cobO的核苷酸序列如SEQIDNO.15所示，cobQ的核苷酸序列如SEQIDNO.16所示，cobC的核苷酸序列如SEQIDNO.17所示，cobD的核苷酸序列如SEQIDNO.18所示；以pACYCDuet-1表达cobA、cobI、cobG、cobJ和cobM，pCDFDuet-1表达cobF、cobK、cobL、cobH和cobB，pETDuet-1表达cobN、cobS和cobT，pRSFDuet-1表达cobR、cobO、cobQ、cobC和cobD。2.根据权利要求1所述的大肠杆菌工程菌株，其特征在于，所述大肠杆菌包括DH5α、JM109、W3110、BL21(DE3)、MG1655。3.根据权利要求1所述的大肠杆菌工程菌株，其特征在于，将PgapA和cobM，cobJ和cobG，cobI和cobA通过融合PCR方法连接，组装为PgapA-cobM，cobJG，cobIA，连接后再与质粒pACYCDuet-1连接；将PgapA和cobB，cobH和cobL，cobK和cobF通过融合PCR方法连接，组装为PgapA-cobB，cobHL，cobKF，连接后再与pCDFDuet-1连接；将PgapA和cobN，cobS和cobT通过融合PCR方法连接，组装为PgapA-cobN，cobST，连接后再与pETDuet-1连接，构建质粒pETDuet-1-PgapA-cobNST；将PgapA和cobD，cobC和cobQ，cobO和cobR通过融合PCR方法连接，组装为PgapA-cobD，cobCQ，cobOR，连接再与pRSFDuet-1连接。4.一种构建权利要求1所述大肠杆菌工程菌株的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：(1)分别将PgapA和cobM，cobJ和cobG，cobI和cobA通过融合PCR方...

【专利技术属性】
技术研发人员：康振，陈坚，堵国成，张俊丽，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32