本发明专利技术提供了一种区别鸭疫里默氏菌和大肠杆菌的引物及其方法，根据鸭疫里默氏菌外膜蛋白A基因和大肠杆菌glyceraldehyde‑3‑phosphate dehydrogenase A基因的保守序列设计两对特异性引物，分别标记于猪线粒体基因片段的两端形成两种不同的捕获探针，将捕获探针与待检测菌的基因组杂交、补平缺口、环化后，采用1对引物反向扩增捕获探针，鸭疫里默氏菌和大肠杆菌的扩增大小分别为504 bp和328 bp。目前尚未见仅用一对引物就能区别鸭疫里默氏菌和大肠杆菌的PCR方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种区别鸭疫里默氏菌和大肠杆菌的引物及其方法。
技术介绍
鸭疫里默氏菌感染常引起雏鸭和雏鹅大批发病和死亡，降低饲料转化率，增加胴体淘汰率，增加治疗费用，是危害水禽业的重要致病菌，病变主要表现为纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎和脑膜炎。大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起鸭和鹅全身或局部感染的一种细菌性传染病，临床上最常见的病型是败血症，病变主要表现为心包炎、腹膜炎和气囊炎。两种病的病变特征相似，但两种病原的耐药特点不一，用药也不一样。临床上仅凭病变特点很难将这两种病区分开来，需要建立快速准确的实验室诊断方法。已有检测鸭疫里默氏菌的PCR方法、检测大肠杆菌的PCR方法、检测鸭疫里默氏菌和大肠杆菌的双重PCR方法，但目前尚未见仅用一对引物就能区别鸭疫里默氏菌和大肠杆菌的PCR方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种区别鸭疫里默氏菌和大肠杆菌的引物及其方法。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种区别鸭疫里默氏菌和大肠杆菌的引物，所述引物包括如下引物对：鸭疫里默氏菌捕获探针的引物：RTZF：ATGGACTTAAGGTTCCAACGCATTAACTGCTAGTCCCCAT，RTZR：CATATCAGCACAGAGTTTATCTGCCGGATCATGAGTTCC；大肠杆菌捕获探针的引物：ETZF：GTGAGTGCCGGCAAAGCTGGCATTAACTGCTAGTCCCCAT，ETZR：TTACGCTGGCTATGCCGGTTGCCGGATCATGAGTTCC；能同时检测鸭疫里默氏菌和大肠杆菌的检测引物：TZTF：CGTCAAAGGCCCTAACACAGT，TZTR：GGTGATACGCATGTTGACTGG。区别鸭疫里默氏菌和大肠杆菌的方法，包括如下步骤：1）捕获探针的制备：提取猪精肉的DNA，配成100 ng/μL的浓度做为模板，分别与鸭疫里默氏菌捕获探针的引物（RTZF/ RTZR）和大肠杆菌捕获探针的引物（TZTF/ TZTR）配制PCR反应体系，总量为50 μL：25 μL Dream Taq Green PCR Master Mix（2×）、1 μL上游引物（浓度为10 μM）、1μL下游引物（浓度为10 μM）、1 μL模板、22 μL ddH2O；PCR反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，52℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环，最后72 ℃延伸10 min；分别凝胶回收PCR产物，制成不同细菌的捕获探针；2）检测引物的设计：设计检测引物，鸭疫里默氏菌应扩增出540 bp的特异性片段，大肠杆菌应扩增出328 bp的特异性片段，序列如下：TZTF：CGTCAAAGGCCCTAACACAGT，TZTR：GGTGATACGCATGTTGACTGG；3）鸭疫里默氏菌和大肠杆菌的PCR检测：配制PCR反应体系，总量为30 μL：3 μL连接酶buffer、3 μL Taq 酶buffer、1 μL连接酶、1 μL Taq 酶、浓度为10 mM 的dNTP 2 μL、浓度为10 μM的检测上游引物即TZTF 1 μL、浓度为10 μM的检测下游引物即TZTR 1 μL、浓度为1 pg/μL的鸭疫里默氏菌捕获探针 2 μL、浓度为1 pg/μL的大肠杆菌捕获探针2 μL、含100 ng DNA模板、补足ddH2O至30 μL。反应程序为94℃预变性5 min；94℃变性50 s ，50℃退火10 min，6个循环，然后94℃变性30 s，50℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环，最后72 ℃延伸10 min。3、如权利要求1所述的引物在制备检测鸭疫里默氏菌和大肠杆菌的试剂盒中的应用。所述的引物在制备检测鸭疫里默氏菌和大肠杆菌的试剂盒中的应用。本专利技术的优点在于：与检测鸭疫里默氏菌的PCR方法、检测大肠杆菌的PCR方法相比，本方法能在一个PCR反应体系和一次PCR反应中同时检测两种细菌，减轻工作量并节省时间，达到快速的目的。与检测鸭疫里默氏菌和大肠杆菌的双重PCR方法相比，特异性更好，准确度更高，因为双重PCR方法设计时比普通PCR难度更高，必须考虑引物和引物之间、引物本身、产物和产物之间不能有错配，相对而言，双重PCR方法的特异性较差，假阳性或假阴性的概率较大。附图说明图1鸭疫里默氏菌的PCR检测，其中1、DNA分子量标准DL2000；2、鸭疫里默氏菌；3、ddH2O。图2大肠杆菌的PCR检测，其中1、DNA分子量标准DL2000；2、大肠杆菌；3、ddH2O。图3鸭疫里默氏菌和大肠杆菌的PCR检测，其中1、DNA分子量标准DL2000；2、鸭疫里默氏菌和大肠杆菌；3、鸭疫里默氏菌；4、大肠杆菌；5、ddH2O。具体实施方式实施例11捕获探针的制备 将猪精肉剪碎，加适量水研磨，按试剂盒的方法提取基因组DNA，用NanoDrop 2000超微量分光光度计测定核酸浓度，配成100 ng/μL的浓度。用鸭疫里默氏菌捕获探针的引物和大肠杆菌捕获探针的引物（见表1）分别配制PCR反应体系，总量为50 μL：25 μL Dream Taq Green PCR Master Mix（2×）、1 μL上游引物（10 μM）、1 μL下游引物（10 μM）、1 μL模板、22 μL ddH2O。PCR反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，52℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环，最后72 ℃延伸10 min。分别凝胶回收PCR产物，用NanoDrop 2000超微量分光光度计测定核酸浓度，配成1 pg/μL的浓度，冰冻保存备用。表1制作探针的引物2检测引物的设计 设计检测引物，鸭疫里默氏菌应扩增出540 bp的特异性片段，大肠杆菌应扩增出328 bp的特异性片段，序列如下：TZTF：CGTCAAAGGCCCTAACACAGT，TZTR：GGTGATACGCATGTTGACTGG；3鸭疫里默氏菌的PCR检测 挑取鸭疫里默氏菌菌落10个左右，按试剂盒的方法提取基因组DNA，用NanoDrop 2000超微量分光光度计测定核酸浓度，配成100 ng/μL的浓度。配制PCR反应体系，总量为30 μL：3 μL连接酶buffer、3 μL Taq 酶buffer、1 μL连接酶、1 μL Taq 酶、2 μL dNTP（10 mM）、1 μL检测上游引物（10 μM）、1 μL检测下游引物（10 μM）、2 μL鸭疫里默氏菌捕获探针（1 pg/μL）、15 μL ddH2O 、模板用1 μL鸭疫里默氏菌核酸（100 ng/μL）或1 μL ddH2O为空白对照。反应程序为94℃预变性5 min；94℃变性50 s ，50℃退火10 min，6个循环，然后94℃变性30 s，50℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环，最后72 ℃延伸10 min。凝胶检测，空白对照无PCR产物，鸭疫里默氏菌核酸可扩增出特异性PCR产物，片段大小约为540 bp，见图1。4大肠杆菌的PCR检测 挑取大肠杆菌菌落10个左右，按试剂盒的方法提取基因组DNA，用NanoDrop 2000超微量分光光度计测定核酸本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种区别鸭疫里默氏菌和大肠杆菌的引物，其特征在于：所述引物包括如下引物对：鸭疫里默氏菌捕获探针的引物：RTZF：ATGGACTTAAGGTTCCAACGCATTAACTGCTAGTCCCCAT，RTZR：CATATCAGCACAGAGTTTATCTGCCGGATCATGAGTTCC；大肠杆菌捕获探针的引物：ETZF：GTGAGTGCCGGCAAAGCTGGCATTAACTGCTAGTCCCCAT，ETZR：TTACGCTGGCTATGCCGGTTGCCGGATCATGAGTTCC；能同时检测鸭疫里默氏菌和大肠杆菌的检测引物：TZTF：CGTCAAAGGCCCTAACACAGT，TZTR：GGTGATACGCATGTTGACTGG。
【技术特征摘要】
1.一种区别鸭疫里默氏菌和大肠杆菌的引物，其特征在于：所述引物包括如下引物对：鸭疫里默氏菌捕获探针的引物：RTZF：ATGGACTTAAGGTTCCAACGCATTAACTGCTAGTCCCCAT，RTZR：CATATCAGCACAGAGTTTATCTGCCGGATCATGAGTTCC；大肠杆菌捕获探针的引物：ETZF：GTGAGTGCCGGCAAAGCTGGCATTAACTGCTAGTCCCCAT，ETZR：TTACGCTGGCTATGCCGGTTGCCGGATCATGAGTTCC；能同时检测鸭疫里默氏菌和大肠杆菌的检测引物：TZTF：CGTCAAAGGCCCTAACACAGT，TZTR：GGTGATACGCATGTTGACTGG。2.利用权利要求1所述的引物区别鸭疫里默氏菌和大肠杆菌的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：1）两种细菌捕获探针的制备：提取猪精肉的DNA，配成100 ng/μL的浓度作模板，与权利要求1所述的鸭疫里默氏菌捕获探针的引物和大肠杆菌捕获探针的引物分别配制PCR反应体系，总量为50 μL：25 μL Dream Taq Green PCR Master Mix（2×）、浓度为10 μM的上游引物1 μL、浓度为10 μM的下游引物1 μL、1 μL模板、22 μL ddH2O；PCR反应条件为：94℃预变性5...
【专利技术属性】
技术研发人员：程龙飞，傅光华，林群群，傅秋玲，刘荣昌，林建生，万春和，施少华，陈红梅，黄瑜，
申请(专利权)人：福建省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：福建;35
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