本发明专利技术公开了一种无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法，其特征在于：包括，构建重组质粒，获得重组大肠杆菌，配制培养基，制备种子液，发酵。与前期已报道的生物法合成乙醇酸相比，本发明专利技术中所提到的乙醇酸发酵技术方案在没有敲除大肠杆菌BL21(DE3)中任何基因的情况下提高了乙醇酸的产量及产率。以葡萄糖为唯一碳源，GL1、GL3、GL2摇瓶发酵产率分别为0.109g/g，0.155g/g，0.248g/g，通过发酵条件优化，GL2上罐发酵时产量达到4.275g/L，产率为0.427g/g。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法。
技术介绍
乙醇酸(glycolicacid，glycolate)又称羟基乙酸(Hydroxyaceticacid)、甘醇酸，是最简单的α—羟基酸。它在化妆品，制药，纺织和制革等行业得到了广泛的应用。已知多种使用相应的α-羟基腈作为原料以及微生物作为催化剂用于制备α-羟基酸的方法。所产生的α-羟基酸的例子包括：乙醇酸、乳酸、2-羟基异丁酸、2-羟基-2-苯丙酸、苦杏仁酸、2-羟基-3，3-二甲基-4-丁内酯和4-甲硫丁酸。这些产物是使用微生物合成的，例如属于诺卡氏菌属(Nocardia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、短杆菌属(Brevibacterium)、金杆菌属(Aureobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、乳酪杆菌属(Caseobacter)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、不动杆菌属(Acinetobacter)、肠杆菌属(Enterobacter)、节杆菌属(Arthrobacter)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、微球菌属(Micrococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、黄杆菌属(Flavobacterium)、气单胞菌属(Aeromonas)、枝动杆菌属(Mycoplana)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、欧文氏菌属(Erwinia)、假丝酵母属(Candida)、无芽孢杆菌属(Bacteridium)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、旋孢腔菌属(Cochliobolus)、镰孢菌属(Fusarium)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、红球菌属(Rhodococcus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、细杆菌属(Microbacterium)、Obsumbacterium和戈登氏菌属(Gordona)的那些微生物(相应于US5,223,416的JP-A-4-99495、JP-A-4-99496和JP-A-4-218385；相应于US5,234,826的JP-A-4-99497；相应于US5,296,373的JP-A-5-95795JP-A-5-21987；相应于US5,326,702的JP-A-5-192189；相应于EP-A-0610048的JP-A-6-237789；相应于EP-A-0610049的JP-A-6-284899；相应于US5,508,181的JP-A-7-213296)。目前乙醇酸的主要生产方式是化学合成，但是该方法的产品收率并不高。此外，在乙醇酸的化学合成过程中需要加入大量的有毒有害的甲醛，并且整个生产过程对环境污染非常大。为了解决上述问题，人们将目光聚焦到生物合成乙醇酸的道路上，且做了大量的基础工作。目前报道的主要生物合成乙醇酸的
方法有微生物酶催化法和全生物合成方法。主要的微生物酶催化法包括利用微生物产腈水解酶水解乙醇腈产乙醇酸以及微生物产甘油氧化酶氧化乙二醇产乙醇酸。全生物合成乙醇酸的方法包括：利用乙二醇作为底物生产乙醇酸及利用大肠杆菌以葡萄糖为底物全生物合成乙醇酸。以葡萄糖为底物全生物合成乙醇酸具有底物廉价，操作简单，产品纯度高等突出优点。尽管研究人员已经在大肠杆菌中实现了利用葡萄糖全生物合成乙醇酸，但是该方法得到的乙醇酸产率较低，在没有敲除基因的情况下，目前已报道的乙醇酸的最高产率为0.157g/g。
技术实现思路
本部分的目的在于概述本专利技术的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和专利技术名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和专利技术名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本专利技术的范围。鉴于上述和/或现有乙醇酸合成中存在的问题，提出了本专利技术。因此，本专利技术目的是解决现有技术中的不足，提供一种无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法。为解决上述技术问题，本专利技术提供了如下技术方案：一种无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法，其特征在于，包括，利用基因组提取试剂盒提取大肠杆菌DH5α基因组，并以此为模板进行PCR扩增目的基因，在35～37℃条件下，NdeI和XhoI双酶切PCR扩增的目的基因1.5～2.5h，PCR产物纯化试剂盒纯化，在35～37℃条件下，NdeI和XhoI双酶切质粒pCOLDuet-11.5～2.5h，利用胶回收试剂盒回收载体片段，用T4连接酶处理目的基因片段与载体片段，在35～37℃培养箱内培养过夜，验证后完成重组质粒的构建，并进行重组大肠杆菌的制备，将甘油保藏的菌种接种于LB液体培养基中，在35～37℃、220～280r/min条件下摇瓶过夜，将过夜培养的种子液离心，并用M9培养基重悬菌体，进行摇瓶发酵或上罐发酵，得到含有乙醇酸的发酵液。作为本专利技术所述无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法的一种优选方案，其中：所述目的基因包括ycdW或aceAK。作为本专利技术所述无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法的一种优选方案，其中：所述用T4连接酶处理目的基因片段与载体片段，包括，用T4
连接酶在15～20℃处理目的基因片段与载体片段7～10小时，将上述连接反应液加入JM109化转感受态中冰上放置25～35min，40～42℃热激80～100s，加入SOC液体培养基，35～37℃摇床孵育0.8～1.2h，以45～55ug/mL涂布卡那抗性平板。作为本专利技术所述无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法的一种优选方案，其中：所述验证后完成重组质粒的构建，包括，挑取菌落进行PCR验证，并将疑似正确菌落转接入LB液体培养基，培养12～16h，利用质粒小提试剂盒提取质粒，NcoI和XhoI酶切验证，得到重组质粒pJNU-1、pJNU-2、pJNU-3。作为本专利技术所述无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法的一种优选方案，其中：所述重组大肠杆菌的制备，包括，将重组质粒加入到BL21(DE3)化转感受态中，混合均匀，冰上放置25～35min，40～42℃热激80～100s，加入SOC液体培养基，35～37℃摇床孵育0.8～1.2h，以45～55ug/mL涂布卡那抗性平板，37℃培养箱培养过夜，挑取单菌落进行PCR验证，并将验证正确的重组大肠杆菌以45～55ug/mL接种于含有硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，摇瓶培养过夜，用12～15％的甘油冷冻保藏。作为本专利技术所述无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法的一种优选方案，其中：所述摇瓶发酵包括，将种子液以1～3％的接种量接种于摇瓶发酵培养基中，使其初始OD600为0.1，在35～37℃、220～280r/min条件下培养至OD600为0.8时加入1mMIPTG诱导表达，并将培养条件改为28～32℃、220～280r/min培养。作为本专利技术所述无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法的一种优选方案，其中：所述摇瓶发酵培养基成分包括4～10g/L葡萄糖、1.5～2.5mMMgSO4、0.08～0.12mMCaCl2或40～60ug/ml硫酸卡那霉素中的一种或几种，其余成分为M9盐溶液。作为本专利技术所述无基因本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法，其特征在于：包括，提取大肠杆菌DH5α基因组，并以此为模板进行PCR扩增目的基因，在35～37℃条件下，NdeI和XhoI双酶切PCR扩增目的基因1.5～2.5h；PCR产物纯化，在35～37℃条件下，NdeI和XhoI双酶切质粒pCOLDuet‑11.5～2.5h，回收载体片段，用T4连接酶处理目的基因片段与载体片段，在35～37℃培养箱内培养，验证后完成重组质粒的构建，并进行重组大肠杆菌的制备；将菌种接种培养，在35～37℃、220～280r/min条件下培育，将培育后的种子液离心，并重悬菌体，进行发酵，得到含有乙醇酸的发酵液。
【技术特征摘要】
1.一种无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法，其特征在于：包括，提取大肠杆菌DH5α基因组，并以此为模板进行PCR扩增目的基因，在35～37℃条件下，NdeI和XhoI双酶切PCR扩增目的基因1.5～2.5h；PCR产物纯化，在35～37℃条件下，NdeI和XhoI双酶切质粒pCOLDuet-11.5～2.5h，回收载体片段，用T4连接酶处理目的基因片段与载体片段，在35～37℃培养箱内培养，验证后完成重组质粒的构建，并进行重组大肠杆菌的制备；将菌种接种培养，在35～37℃、220～280r/min条件下培育，将培育后的种子液离心，并重悬菌体，进行发酵，得到含有乙醇酸的发酵液。2.根据权利要求1所述的无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法，其特征在于：所述目的基因包括ycdW和/或aceAK。3.根据权利要求1或2所述的无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法，其特征在于：所述用T4连接酶处理目的基因片段与载体片段，包括，用T4连接酶在15～20℃处理目的基因片段与载体片段7～10小时，将上述连接反应液加入JM109化转感受态中冰上放置25～35min，40～42℃热激80～100s，加入SOC液体培养基，35～37℃摇床孵育0.8～1.2h，以45～55ug/mL涂布卡那抗性平板。4.根据权利要求1所述的无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法，其特征在于：所述验证后完成重组质粒的构建，包括，挑取菌落进行PCR验证，并将疑似正确菌落转接入培养基，培养12～16h，然后提取质粒，酶切验证，得到重组质粒pJNU-1、pJNU-2、pJNU-3。5.根据权利要求1、2或4中任一项所述的无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法，其特征在于...
【专利技术属性】
技术研发人员：邓禹，张晓娟，马宁，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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