一种无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法技术

本发明专利技术公开了一种无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法，其特征在于：包括，构建重组质粒，获得重组大肠杆菌，配制培养基，制备种子液，发酵。与前期已报道的生物法合成乙醇酸相比，本发明专利技术中所提到的乙醇酸发酵技术方案在没有敲除大肠杆菌BL21(DE3)中任何基因的情况下提高了乙醇酸的产量及产率。以葡萄糖为唯一碳源，GL1、GL3、GL2摇瓶发酵产率分别为0.109g/g，0.155g/g，0.248g/g，通过发酵条件优化，GL2上罐发酵时产量达到4.275g/L，产率为0.427g/g。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法。
技术介绍
乙醇酸(glycolicacid，glycolate)又称羟基乙酸(Hydroxyaceticacid)、甘醇酸，是最简单的α—羟基酸。它在化妆品，制药，纺织和制革等行业得到了广泛的应用。已知多种使用相应的α-羟基腈作为原料以及微生物作为催化剂用于制备α-羟基酸的方法。所产生的α-羟基酸的例子包括：乙醇酸、乳酸、2-羟基异丁酸、2-羟基-2-苯丙酸、苦杏仁酸、2-羟基-3，3-二甲基-4-丁内酯和4-甲硫丁酸。这些产物是使用微生物合成的，例如属于诺卡氏菌属(Nocardia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、短杆菌属(Brevibacterium)、金杆菌属(Aureobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、乳酪杆菌属(Caseobacter)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、不动杆菌属(Acinetobacter)、肠杆菌属(Enterobacter)、节杆菌属(Arthrobacter)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、微球菌属(Micrococc本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法，其特征在于：包括，提取大肠杆菌DH5α基因组，并以此为模板进行PCR扩增目的基因，在35～37℃条件下，NdeI和XhoI双酶切PCR扩增目的基因1.5～2.5h；PCR产物纯化，在35～37℃条件下，NdeI和XhoI双酶切质粒pCOLDuet‑11.5～2.5h，回收载体片段，用T4连接酶处理目的基因片段与载体片段，在35～37℃培养箱内培养，验证后完成重组质粒的构建，并进行重组大肠杆菌的制备；将菌种接种培养，在35～37℃、220～280r/min条件下培育，将培育后的种子液离心，并重悬菌体，进行发酵，得到含有乙醇酸的发酵液。

【技术特征摘要】
1.一种无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法，其特征在于：包括，提取大肠杆菌DH5α基因组，并以此为模板进行PCR扩增目的基因，在35～37℃条件下，NdeI和XhoI双酶切PCR扩增目的基因1.5～2.5h；PCR产物纯化，在35～37℃条件下，NdeI和XhoI双酶切质粒pCOLDuet-11.5～2.5h，回收载体片段，用T4连接酶处理目的基因片段与载体片段，在35～37℃培养箱内培养，验证后完成重组质粒的构建，并进行重组大肠杆菌的制备；将菌种接种培养，在35～37℃、220～280r/min条件下培育，将培育后的种子液离心，并重悬菌体，进行发酵，得到含有乙醇酸的发酵液。2.根据权利要求1所述的无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法，其特征在于：所述目的基因包括ycdW和/或aceAK。3.根据权利要求1或2所述的无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法，其特征在于：所述用T4连接酶处理目的基因片段与载体片段，包括，用T4连接酶在15～20℃处理目的基因片段与载体片段7～10小时，将上述连接反应液加入JM109化转感受态中冰上放置25～35min，40～42℃热激80～100s，加入SOC液体培养基，35～37℃摇床孵育0.8～1.2h，以45～55ug/mL涂布卡那抗性平板。4.根据权利要求1所述的无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法，其特征在于：所述验证后完成重组质粒的构建，包括，挑取菌落进行PCR验证，并将疑似正确菌落转接入培养基，培养12～16h，然后提取质粒，酶切验证，得到重组质粒pJNU-1、pJNU-2、pJNU-3。5.根据权利要求1、2或4中任一项所述的无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓禹，张晓娟，马宁，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32