一种光学纯2-羟基丁酸的生物制备新方法技术

本发明专利技术涉及(R)-2-羟基丁酸与(S)-2-羟基丁酸的生物合成新方法。更具体的，本发明专利技术提供了一种利用苏氨酸脱水酶、乳酸脱氢酶与甲酸脱氢酶催化苏氨酸一锅法生产(R)-2-羟基丁酸或(S)-2-羟基丁酸的方法，所述的(R)-2-羟基丁酸与(S)-2-羟基丁酸可广泛应用于药物合成、生物可降解材料及精细化学品的合成。本方法具有反应条件温和、无污染和工艺路线简单等显著特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物催化制备药物中间体和绿色化学领域，涉及一种由苏氨酸一锅法制备光学纯2-羟基丁酸的方法。主要涉及一种(R)-2-羟基丁酸与(S)-2-羟基丁酸的生物制备新方法。
技术介绍
手性2-羟基丁酸可广泛应用于药物合成、生物可降解材料及精细化学品的合成。如(R)-2-羟基丁酸可用于抗癫痫药物左乙拉西坦及布瓦西坦的合成，(S)-2-羟基丁酸则可用于PPARα拮抗剂(R)-K-13675与PPARγ拮抗剂MK-0533的合成。此外，光学纯的2-羟基丁酸在生物可降解材料领域也有巨大的应用前景。文献报道光学纯2-羟基丁酸的生产主要有2-丁酮酸的酶催化还原法、2-羟基丁酸的酶催化拆分法，如马翠卿等（CN101974603）报道了利用含NAD(烟酰胺腺嘌呤双核苷酸)非依赖性l-羟酸脱氢酶的微生物完整细胞或粗酶液拆分2-羟基丁酸生成(R)-2-羟基丁酸及2-丁酮酸的方法。由于2-丁酮酸及2-羟基丁酸生产成本较高，致使光学醇2-羟基丁酸生产成本居高不下。文献调研发现苏氨酸脱水酶可以催化苏氨酸脱水生成2-丁酮酸，但是，由于2-丁酮酸对该酶具有较大的抑制作用，致使累积的产物浓度不是很高。我们发现目前生物催化合成(R)-2-羟基丁酸或(S)-2-羟基丁酸的工艺中，尚没有利用生物催化剂由苏氨酸一锅法合成(R)-2-羟基丁酸或(S)-2-羟基丁酸的方法。本方法利用苏氨酸脱水酶、乳酸脱氢酶与甲酸脱氢酶进行串联反应或在基因工程菌中共表达苏氨酸<br>脱水酶、乳酸脱氢酶与甲酸脱氢酶，由苏氨酸一锅法制备(R)-2-羟基丁酸或(S)-2-羟基丁酸。该过程具有反应条件温和、反应速度快、无污染和工艺路线简单等显著特点。
技术实现思路
针对已报道制备方法中(R)-2-羟基丁酸或(S)-2-羟基丁酸产物浓度低、光学纯度不高、生产成本高等问题，本专利技术提出利用苏氨酸脱水酶、乳酸脱氢酶与甲酸脱氢酶催化苏氨酸一锅法生产(R)-2-羟基丁酸或(S)-2-羟基丁酸。（如化学方程式1）。化学方程式1合成路线。本专利技术的具体步骤如下：1.单表达载体的构建本专利技术中所述的产苏氨酸脱水酶的基因工程菌，具体的构建方法是：以大肠杆菌K12基因组DNA为模板，根据预先设计好的引物ilvA-F（CGCGGATCCGATGGCTGACTCGCAAC）和ilvA-R（CCCAAGCTTTCACTAACCCGCCAAAAAG）的PCR扩增条件和扩增体系进行PCR，得到ilvA基因，BamHI和HindIII双酶切后与BamHI和HindIII双酶切后的pRSFduet载体连接，转化BL21(DE3)感受态，挑取单克隆摇菌，提质粒进行双酶切验证，酶切片段大小正确的质粒进行测序进一步验证。本专利技术中所述的产乳酸脱氢酶的基因工程菌，具体的构建方法是：将来源于表皮葡萄球菌（Staphylococcusepidermidis）ATCC12228的D型乳酸脱氢酶基因（D-LDH）和来源于家兔（Oryctolaguscuniculus）的L型乳酸脱氢酶基因（L-LDH）由上海旭冠公司合成，分别连接在pRSFduet和pET32a载体上。然后将表达载体分别转入BL21(DE3)感受态，挑取单克隆摇菌，并对基因工程菌进行发酵培养，实现了D型乳酸脱氢酶与L型乳酸脱氢酶的高效异源表达。2.双酶共表达载体的构建分别将pRSFduet-D-LDH和pET32a-L-LDH用NdeI和XhoI酶切，胶回收D-LDH和L-LDH基因片段，分别连接到pRSFduet-ilvA载体的第二个表达框，转化BL21(DE3)感受态，挑取单克隆摇菌，提质粒进行双酶切验证，酶切片段大小正确的质粒进行测序进一步验证，得到pRSFduet-ilvA-D-LDHandpRSFduet-ilvA-L-LDH双酶共表达载体。3.三酶共表达载体的构建从本实验室保存质粒pET21d-FDH上扩增得到来源于博伊丁假丝酵母（Candidaboidinii）的甲酸脱氢酶的整个表达框（包含RBS序列和启动子），通过互补序列用一步克隆试剂盒将片段连接在pRSFduet-ilvA-L-LDHandpRSFduet-ilvA-D-LDH双表达载体上，转化BL21(DE3)感受态，挑取单克隆摇菌，提质粒进行双酶切验证，酶切片段大小正确的质粒进行测序进一步验证，得到pRSFduet-ilvA-L-LDH-FDH和pRSFduet-ilvA-D-LDH-FDH三酶共表达载体。然后将分别表达载体转入BL21(DE3)感受态，挑取单克隆摇菌，并对基因工程菌进行发酵培养，实现高效异源表达。4.酶的表达与菌体收集将含有质粒的大肠杆菌BL21(DE3)在37℃摇床过夜培养种子液，1%接种LB液体培养基中进行培养，37℃培养至OD600约0.8后，向其中加入终浓度0.1mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达，诱导温度为25℃，诱导时间为20小时。诱导表达结束后，于6000rpm离心20分钟收集菌体。本专利技术中所述的苏氨酸脱水酶、乳酸脱氢酶与甲酸脱氢酶重组菌及三酶共表达重组菌所用到的载体系列包括：pET系列质粒、pTXB1系列、pGEX系列、pETduet系列、pTYB系列。本专利技术中所述的苏氨酸脱水酶、乳酸脱氢酶与甲酸脱氢酶重组菌及三酶共表达重组菌，其特征在于所述的能高效表达外源基因的宿主菌为下列之一：BL21系列、Rosetta系列、Origami系列、Tuner系列。在本专利技术中，由构建的苏氨酸脱水酶质粒、D-乳酸脱氢酶质粒、L-乳酸脱氢酶质粒、甲酸脱氢酶质粒以及三酶共表达质粒转化宿主得到的转化体可以基于已知信息生长并产生本专利技术所述的苏氨酸脱水酶、D-乳酸脱氢酶、L-乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶。任何一种人工的或天然的含有合适碳源、氮源、无机和其他营养物质的介质，只要能满足宿主菌体的生长并且能够表达出目的蛋白均可使用。培养方法和培养条件没有明确的限制，可以根据培养方法和类型等的不同而进行适当的选择，只要能满足宿主生长并能产生相应活性的苏氨酸脱水酶、D-乳酸脱氢酶、L-乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶即可。本专利技术还涉及利用苏氨酸脱水酶、甲酸脱氢酶和D-乳酸脱氢酶或L-乳酸脱氢酶转化苏氨酸制备(R)-2-羟基丁酸或(S)-2-羟基丁酸的方法，所述方法为：1）将所述产苏氨酸脱水酶、甲酸脱氢酶、D-乳酸脱氢酶或L-乳酸脱氢酶的基因工程菌经种子培养基培养，按一定比例接种到发酵培养基，培养一定时间后，加入诱导剂IPTG或乳糖或二者混合物诱导培养一定时间，离心收集菌体，然后将苏氨酸脱水酶、甲酸脱氢酶和本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生物合成(R)‑2‑羟基丁酸与(S)‑2‑羟基丁酸的新方法，其特征在于利用苏氨酸脱水酶、乳酸脱氢酶与甲酸脱氢酶或它们共表达重组菌催化苏氨酸一锅法制备(R)‑2‑羟基丁酸或(S)‑2‑羟基丁酸，包括如下步骤：a）苏氨酸脱水酶重组菌、甲酸脱氢酶重组菌和D/L‑乳酸脱氢酶重组菌及三酶共表达重组菌的构建；b）将苏氨酸脱水酶重组菌、甲酸脱氢酶重组菌和D/L‑乳酸脱氢酶重组菌及三酶共表达重组菌分别在发酵培养基中扩增培养，并进行诱导产生目的蛋白后，离心收集菌体；c）将收集的苏氨酸脱水酶重组菌、甲酸脱氢酶重组菌和D/L‑乳酸脱氢酶重组菌或三酶共表达重组菌，加入到含水、苏氨酸、磷酸氢二钠、甲酸钠、磷酸吡哆醛（PLP）与烟酰胺腺嘌呤双核苷酸（NAD+），调节pH至7.0，在适当条件下反应一定时间，底物经过中间产物2‑丁酮酸，最终转化为(R)‑2‑羟基丁酸或(S)‑2‑羟基丁酸；d）反应用盐酸酸化中止后从反应体系中收集上层清液，并用乙酸乙酯萃取多次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸回收溶剂得到目标产物。

【技术特征摘要】
1.一种生物合成(R)-2-羟基丁酸与(S)-2-羟基丁酸的新方法，其特征在于利用苏氨酸
脱水酶、乳酸脱氢酶与甲酸脱氢酶或它们共表达重组菌催化苏氨酸一锅法制备(R)-2-羟基
丁酸或(S)-2-羟基丁酸，包括如下步骤：
a）苏氨酸脱水酶重组菌、甲酸脱氢酶重组菌和D/L-乳酸脱氢酶重组菌及三酶共表达重
组菌的构建；
b）将苏氨酸脱水酶重组菌、甲酸脱氢酶重组菌和D/L-乳酸脱氢酶重组菌及三酶共表达
重组菌分别在发酵培养基中扩增培养，并进行诱导产生目的蛋白后，离心收集菌体；
c）将收集的苏氨酸脱水酶重组菌、甲酸脱氢酶重组菌和D/L-乳酸脱氢酶重组菌或三酶
共表达重组菌，加入到含水、苏氨酸、磷酸氢二钠、甲酸钠、磷酸吡哆醛（PLP）与烟酰胺腺嘌
呤双核苷酸（NAD+），调节pH至7.0，在适当条件下反应一定时间，底物经过中间产物2-丁酮
酸，最终转化为(R)-2-羟基丁酸或(S)-2-羟基丁酸；
d）反应用盐酸酸化中止后从反应体系中收集上层清液，并用乙酸乙酯萃取多次，合并
有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸回收溶剂得到目标产物。
2.如权利要求1所述的a）步骤产苏氨酸脱水酶、乳酸脱氢酶与甲酸脱氢酶的共表达基
因工程菌，其特征在于同时将苏氨酸脱水酶、D/L-乳酸脱氢酶与甲酸脱氢酶构建到同一个
载体上，并转化到宿主菌进行诱导表达。
3.如权利要求1所述的a）步骤产苏氨酸脱水酶、D/L-乳酸脱氢酶或甲酸脱氢酶的基因
工程菌，其特征在于将苏氨酸脱水酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚培圆，崔云凤，冯进辉，吴洽庆，朱敦明，马延和，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12