一种微生物转化的方法技术

本发明专利技术涉及采用普罗维登斯菌属微生物转化L-苯丙氨酸生产R-(+)-2-羟基-3-苯基丙酸。该方法过程简单，具有重要的工业应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种微生物转化的方法
本专利技术采用普罗维登斯菌转化L-苯丙氨酸生产D-苯乳酸，属于工业微生物领域。
技术介绍
D-苯乳酸，学名R-(+)-2-羟基-3-苯基丙酸，英文名为：R-(+)-2-hydroxy-3-phenylpropanoicacid、D-(+)-3-Phenyllacticacid。苯乳酸是近年来发现可以由部分乳酸菌分泌产生的一种新型生物防腐剂。它有D-苯乳酸和L-苯乳酸两种对映异体体，能够有效抑制多种引起食物腐败的细菌及产生毒素的真菌。研究表明D-苯乳酸的抑菌能力略高于L-苯乳酸。作为一种新型生物防腐剂，苯乳酸在食品工业中具重要的应用价值。当前主要通过大肠基因工程菌表达乳酸脱氢酶转化苯丙酮酸生产，如中国专利CN201410818165.X、CN201410393768.X和CN201210338378.3。也有通过各类乳酸菌转化苯丙酮酸或苯丙氨酸生产，如中国专利CN201510089823.0、CN201210005544.8等。也有采用芽孢杆菌转化苯丙酮酸产苯乳酸的方法(EfficientConversionofPhenylpyruvicAcidtoPhenyllacticAcidbyUsingWholeCellsofBacilluscoagulansSDM，2011，PLoSOne.6(4):e19030)。基于D-苯乳酸的重要应用价值，本专利提出了普罗维登斯菌属微生物转化L-苯丙氨酸生产D-苯乳酸的方案。L-苯丙氨酸当前主要通过微生物发酵法生产，原料丰富易得。普罗维登斯菌(Providencia)是一类可使苯丙氨酸氧化脱氨的革兰氏阴性细菌。现有主要8个种：产碱普罗威登斯菌(Providenciaalcalifaciens)、斯氏普罗威登斯菌(Providenciastuartii)、雷极普罗威登斯菌(Providenciarettgeri)、害虫普罗威登斯菌(Providenciavermicola)、Providenciasneebia、Providenciaburhodogranariea。普罗维登斯菌具有强大的氧化脱氨能力(SherrisMedicalMicrobiology，2004，4thed.)，相关文献认为这些微生物只能将L-苯丙氨酸氧化成苯丙酮酸，而无法进一步还原成苯乳酸(α-ketoacidsarenovelsiderophoresinthegeneraproteus,providencia,andmorganellaandareproducedbyaminoaciddeaminases，1993，Journalofbacteriology,175(9),2727-2733)，这可能与之条件选择不当有关。本专利技术可通普罗维登斯菌微生物将L-苯丙氨酸转化成光学纯的D-苯乳酸。苯丙酮酸虽然是更为直接的底物，但价格较高，因此L-苯丙氨酸是最佳的底物。普罗维登斯菌是一种兼性厌氧菌，可以在厌氧条件或好氧条件下转化生产D-苯乳酸，具有高转化率和高纯度的特点。
技术实现思路
本专利技术通过培养普罗维登斯菌属微生物菌体，转化L-苯丙氨酸生产D-苯乳酸，技术方案如下：1、菌株本专利技术所用的菌株有购自美国ATCC菌种库的ProvidenciaalcalifaciensATCC9886、ProvidenciarustigianiiATCC33673、ProvidenciasneebiaATCCBAA-1589、ProvidenciarettgeriATCC29944、ProvidenciaheimbachaeATCC35613、ProvidenciastuartiiATCC33672、ProvidenciaburhodogranarieaATCCBAA-1590以及购自中国工业微生物菌种保藏管理中心的ProvidenciarettgeriCICC10488和中国典型培养物保藏中心的ProvidenciavermicolaCCTCCAB205297。2、菌体培养液态发酵培养基组成为：碳源0-50g/L，氮源0-50g/L，磷酸氢二铵0-2g/L，磷酸二氢钾0-1g/L，硫酸镁0-0.5g/L，硫酸亚铁0-0.5g/L，氯化纳0-5g/L，可调节pH至2-8，可也pH自然；接种量为5-20％，发酵温度为20-40℃，发酵周期为24-72小时。种子和发酵均采用此培养基。用于培养菌种的碳源可以是葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖、蔗糖、半乳糖、甘油。培养用氮源可以是硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、蛋白胨、酵母膏、尿素、玉米浆等有机氮源。碳源和氮源可以是一种或多种的组合。液态培养菌体的过程可以采用厌氧或好氧方式。3、转化产D-苯乳酸转化过程采用的方案有2种：(1)细胞的液态培养过程，将L-苯丙氨酸底物加入上述的培养体系中；L-苯丙氨酸添加量为0-20g/L。(2)将液态发酵培养物离心去除发酵液得到菌体，将菌体放入含有L-苯丙氨酸底物的水溶液反应体系中进行；转化过程温度20-40℃，pH2-8，转化时间1-24小时。转化液中L-苯丙氨酸起始浓度为0.1-20g/L。4、样品的检测分析转化液采用PerkinElmerSeries200高效液相色谱仪检测分析，色谱条件为：流动相是甲醇-0.1％甲酸水(40:60)、采用汉邦MegresC18色谱柱(4.6×250mm，5μm)，流速0.6ml/min、柱温30℃、进样量20μl、检测器波长200nm。采用江苏汉邦科技有限公司的DAC-HB50制备色谱柱制备转化样品，制备色谱条件为：流动相50％甲醇、柱温自然、流速3ml/min、进样量5ml。样品达到色谱纯99.9％，反复进样分离得到的产品于50℃下真空旋转蒸干。称取制备得到的样品0.5g，溶于去离子水中并定容至50ml，采用日本爱宕AP-300全自动旋光仪测定放光度。进一步采VarianGemini2000(VnmrS600MHz,600/54/ASP)分析样品的核磁数据。样品进一步采用UPLC-QTOF-MS法分析分子量，仪器为WatersMALDISYNAPTQTOFMS液相色谱串联四极杆飞行时间质谱仪。具体实施方式实施例1转化产物的分析测定。配制培养基如下：酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L。500ml三角瓶中装液量为100ml，共100瓶，120℃，20分钟灭菌。取ProvidenciarustigianiiATCC33673甘油管种子液1mL接种，发酵温度30℃，摇床转速200rpm。培养24后，将发酵液离心(转速10000rpm，时间10min)，去除上清液获得菌体，离心获得的菌体用无菌水清洗两遍。取40g湿菌体放入L-苯丙氨酸浓度为20g/L的1000ml溶液中，混合均匀。于37℃摇床振荡(100rpm)48小时后，100℃水浴加热3分钟杀灭菌体。再离心(转速10000rpm，时间10min)去除菌体，得到转化后的上清液。液相分析D-苯乳酸浓度为10.1g/L，剩余L-苯丙氨酸浓度为7.3g/L。采用制备色谱得到8.2g纯品。旋光仪分析其旋光度为核磁数据为:1HNMR(CDCl3600MHz):δ7.33(2H,dJ7.6Hz),7.29(1H,d,J7.6Hz),7.24(2H,d,J本文档来自技高网...

【技术保护点】
普罗维登斯菌属微生物转化L‑苯丙氨酸生产R‑(+)‑2‑羟基‑3‑苯基丙酸，具体的微生物有：产碱普罗威登斯菌、斯氏普罗威登斯菌、雷极普罗威登斯菌、害虫普罗威登斯菌、Providencia sneebia、Providencia burhodogranariea。

【技术特征摘要】
1.一种转化L-苯丙氨酸生产R-(+)-2-羟基-3-苯基丙酸的方法，其特征在于，所述方法是利用普罗维登斯菌属微生物进行转化生产；所述普罗维登斯菌属微生物为保藏编号分别为ATCC33673、ATCC29944、CICC10488、ATCC35613、CCTCCAB205297、ATCC9886、ATCCBAA-1589、ATCC33672、ATCCBAA-1590的菌株；转化过程采用的步骤如下：(1)细胞的液态培养过程，将L-苯丙氨酸底物加入培养体系中；L-苯丙氨酸添加量为0-20g/L；(2)将液态发酵培养物离心去除发酵液得到...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡宇杰，沈天成，邓华祥，陈佳君，钟妮尔，王静，白亚军，郑晓晖，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32