本文件描述了通过在C6脂肪族主链底物中形成两个末端官能团(包括羧基、胺或羟基基团)生成己二酸、己内酰胺、6-氨基己酸、6-羟基己酸、己亚甲基二胺或1,6-己二醇的生物化学途径。本文中描述的这些途径、代谢工程和培养策略取决于与聚羟基烷酸酯积累细菌的碳储存途径相关的CoA依赖性延长酶或者类似的酶。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】经由与碳储存有关的CoA依赖性碳链延长生成6碳化学品 的方法 对相关申请的交叉引用 本申请是2011年12月14日提交的美国申请流水号13/715,981的部分连续案， 其要求2011年12月16日提交的美国申请流水号61/576, 401的优先权。通过提及完整并 入申请的公开内容。 专利
本专利技术涉及使用一种或多种分离的酶（诸如0 _酮硫解酶、脱氢酶、还原酶、硫酯 酶、水合酶、单加氧酶、和转氨酶）或使用表达一种或多种此类酶的重组宿主细胞生物合成 己二酸（adipicacid)、6-氨基己酸、6-羟基己酸、己亚甲基二胺、己内酰胺、和1，6-己二醇 中一种或多种的方法。 专利技术背景 尼龙是聚酰胺，其通常通过二胺与二羧酸的缩聚合成。类似地，尼龙可通过内酰胺 的缩聚生成。一种无处不在的尼龙是尼龙6, 6,其通过六亚甲基二胺（HMD)和己二酸的反应 生成。尼龙6可以通过己内酰胺的开环聚合生成。因此，己二酸、己亚甲基二胺和己内酰胺 是尼龙生产中的重要中间体（Anton&Baird,PolyamidesFibers,EncyclopediaofPolymer ScienceandTechnology, 2001)〇 在产业上，经由环己胺的空气氧化生产己二酸和己内酰胺。环己胺的空气氧 化在一系列的步骤中生成环己酮（K)和环己醇㈧的混合物，称为KA油。KA油的硝 酉爱氧化生成己二酉爱(Musser,Adipicacid,Ullmann'sEncyclopediaofIndustrial Chemistry, 2000)。己内酰胺从环己酮经由其聘和随后的酸重排生成（Fuchs,Kieczkaand Moran,Caprolactam,Ullmann,sEncyclopediaofIndustrialChemistry, 2000)〇 在产业上，通过将C6结构单元氢氰化成己二腈，接着氢化成HMD(HerzogandSmi ley,Hexamethylenediamine,Ullmann,sEncyclopediaofIndustrialChemistry, 2012) 生产己亚甲基二胺（HMD)。 鉴于对石油化学给料的依赖性；生物技术提供了一种经由生物催化的备选方法。 生物催化是使用生物催化剂（诸如酶）来实施有机化合物的生物化学转化。 生物衍生给料和石油化学给料两者是用于生物催化过程的可行起始材料。 因而，针对此背景，清楚的是需要用于生成己二酸、己内酰胺、6-氨基己酸、6-羟 基己酸、己亚甲基二胺、和1，6-己二醇（下文为"C6结构单元"）中一种或多种的可 持续方法，其中所述方法是基于生物催化剂的（Jang等，Biotechnology&Bioengineeri ng，2012, 109(10)，2437 - 2459)。 然而，无野生型原核生物或真核生物天然过度生成C6结构单元或将其 排出至胞外环境。不过，已经报告了己二酸和己内酰胺的代谢（Ramsay等，Appl. Environ.Microbiol. , 1986, 52(1), 152 - 156 ；及KulkarniandKanekar,Current Microbiology, 1998, 37, 191 - 194)。 二羧酸己二酸作为碳源经由氧化被众多细菌和真菌有效转化成中心代谢物。 辅酶A(C〇A)活化的己二酸到CoA活化的3-氧代己二酸的氧化经由例如与芳香族底物 降解有关的途径促进进一步代谢。已经广泛表征了 3-氧代己二酰基-CoA被几种细菌和 真菌分解代谢成乙酰基-CoA和琥泊酰基-CoA(HarwoodandParales,AnnualReviewof Microbiology, 1996, 50:553 - 590)。己二酸和6-氨基己酸两者都是己内酰胺的分解代谢 中的中间体，其最终经由3-氧代己二酰基被降解成中心代谢物。 已经提示了用于从生物量-糖生成己二酸的潜在代谢途径：（1)经由邻位切割芳 香族降解途径从葡萄糖以生物化学方式得到顺，顺 -粘康酸（cis，cis-muconicacid)，接 着化学催化成己二酸；（2)经由琥珀酰基-CoA和乙酰基-CoA的缩合的可逆己二酸降解途 径和（3)组合0 _氧化、脂肪酸合酶和氧化。然而，尚未报告使用这些策略的信息（Jang 等，Biotechnology&Bioengineering，2012, 109 (10)，2437 - 2459) 〇 最优性原理陈述微生物调节其生物化学网络以支持最大生物量生长。超出宿主 生物体中表达异源路径的需要，将碳流量引向充当碳源而非充当生物量生长成分的C6结 构单元与最优性原理矛盾。例如，与天然生产者的产量性能相比，将1-丁醇途径从梭菌 (Clostridium)物种转移入其它生产菌株中经常下降一个数量级（Shen等，Appl.Environ. Microbiol. , 2011, 77(9), 2905 - 2915) 〇 在C6脂肪族主链上形成末端官能团（诸如羧基、胺或羟基基团）前，6碳脂肪族主 链前体的有效合成是合成C6结构单元中的重要考虑因素。 专利技术概述 本文件至少部分基于如下的发现：有可能构建生成6碳链脂肪族主链前体的生物 化学路径，其中可以形成两个官能团（例如羧基、胺或羟基），从而导致己二酸、6-氨基己 酸、6-羟基己酸、己亚甲基二胺、己内酰胺、和1，6-己二醇（下文为"C6结构单元"）中一种 或多种的合成。己二酸和己二酸盐、6-羟基己酸和6-羟基己酸盐及6-氨基己酸和6-氨基 己酸盐在本文中可互换使用，指其任何中性或离子化形式的化合物，包括其任何盐形式。本 领域技术人员应当理解，具体的形式会取决于pH。本文中描述的这些途径、代谢工程和培养 策略取决于与聚羟基烷酸酯积累细菌的碳储存途径相关的其CoA依赖性延长酶或者同源 物。 面对最优性原理，令人惊讶地发现了可以组合合适的非天然途径、给料、宿主微生 物、对宿主生物化学网络的弱化策略和培养策略来有效生成C6结构单元。 在一些实施方案中，可以使用NADH或NADPH依赖性酶经由两个循环的CoA依赖性 碳链延长从乙酰基-CoA形成用于转化成C6结构单元的C6脂肪族主链。参见图1和图2。 在一些实施方案中，生成C6脂肪族主链的CoA依赖性碳链延长途径中的酶催化不 可逆酶促步骤。 在一些实施方案中，可以使用硫酯酶、醛脱氢酶、6-氧代己酸脱氢酶、7-氧代庚酸 脱氢酶、或单加氧酶（例如与氧化还原酶和铁氧还蛋白组合）酶促形成末端羧基基团。参见 图3和图4。硫酯酶可以与SEQIDNO: 1中所列的氨基酸序列具有至少70%序列同一性。 在一些实施方案中，可以使用转氨酶或脱乙酰酶酶促形成末端胺基团。参见 图5和图6。转氨酶可以与SEQIDN0:7-12中所列的任一种氨基酸序列具有至少70% 序列同一性。 在一些实施方案中，可以使用单加氧酶（例如与氧化还原酶和铁氧还蛋白组合） 或醇脱氢酶酶促形成末端羟基基团。参见图7和图8。单加氧酶可以与SEQIDN0:13-15 中所列的任一种氨基酸序列具有至少70%序列同一性。 在一个方面，本文件特征在于一种用于生物合成一种或多种选自己二酸、6本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于生物合成一种或多种选自己二酸、6‑氨基己酸、6‑羟基己酸、己亚甲基二胺、己内酰胺、和1,6‑己二醇的产物的方法，所述方法包括经由两个循环的CoA依赖性碳链延长从乙酰基‑CoA酶促合成6碳链脂肪族主链，并且在一个或多个步骤中在所述主链中酶促形成两个选自羧基、胺、和羟基基团的末端官能团以直接生成所述产物或在随后的步骤中生成所述产物。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：AL博特斯，AVE康拉迪，
申请(专利权)人：英威达技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH
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