利用微生物发酵甘油生产3-羟基丙酸的方法技术

本发明专利技术涉及一种利用微生物发酵甘油生产3-羟基丙酸的方法，其中包括具有甘油脱水活性，转化甘油生成3-羟基丙醛或1,3-丙二醇的微生物一和转化3-羟基丙醛或1,3-丙二醇生成3-羟基丙酸的微生物二。微生物一选自：克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)等以及其基因工程菌；微生物二为氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)，以及其基因工程菌。采用该种方法以甘油为底物，应用两种微生物进行分段、混菌发酵生产3-羟基丙酸，与现有基因工程菌为主的单菌发酵方法相比可提高终产物浓度及甘油到3-羟基丙酸的转化率，可转化发酵液里的乳酸生成乙酸，从而降低副产物乳酸浓度减缓分离纯化压力。本发明专利技术中3-羟基丙酸浓度可达75gL-1以上，具有良好的工业应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物工程
，尤其涉及微生物发酵领域，具体是指一种利用微 生物发酵甘油生产3-羟基丙酸的方法。
技术介绍
3-羟基丙酸（3-hydroxypropionicacid，简称3-HP)是一种重要的平台化合物， 它可以通过脱水、氧化还原、酯化反应等生成丙烯酸、丙二酸、1，3-丙二醇等多种重要的化 学物质。它也可以作为单体合成环境友好的高分子材料-聚羟基烷酸。另外，它还可以作 为化工原料用于涂料、粘胶剂、水处理化学品和个人护理用品的生产，2004年美国能源部曾 将其列为最具开发价值的12种化工产品之一。 目前3-羟基丙酸的制备主要为化学法，如丙烯酸水合法，3-羟基丙醛氧化法， 3_羟基丙腈水解法及雷福尔马斯基（Reformatsky)反应等。但化学法原料多来自石油，且 存在对设备要求高，能耗高，污染大等问题。与之相比，生物法具有操作简单、条件温和、绿 色环保等优点，因此倍受关注备受国内外研宄人员的青睐。 微生物产3-HP早在上世纪60年代就有报道，但是天然存在的菌株所需底物价格 高且3-HP产率都比较低，因此长期处于实验室阶段。近年来，随着分子生物学技术的发展， 大量研宄开始集中于对天然菌株进行途径改造，利用重组菌以甘油或葡萄糖等廉价碳源为 底物生产3-HP。基因工程菌的构建按照底物的不同主要分成葡萄糖为底物和甘油底物两 种。葡萄糖为底物的转化路线以美国嘉吉（Cargill)公司的研宄最为成熟，该公司构建了 多条从葡萄糖到3-HP的路径，其中最具代表性的过程为：葡萄糖经酵解途径到丙酮酸，丙 酮酸还原生成乳酸，乳酸在丙酰CoA转移酶的作用下生成乳酰CoA，后者在乳酰CoA脱水酶 作用下生成丙烯酰CoA，进而在3-羟基丙酰脱水酶的作用下，生成3-羟基丙酰CoA，最终生 成3-羟基丙酸。 以甘油为底物生成3-HP通常有两步反应组成：甘油先经甘油脱水酶脱水生成 3-羟基丙醛，3-羟基丙醛经醛脱氢酶脱氢生成3-HP。与葡萄糖相比，甘油到3-HP生成路径 短，构建和调控更加简单有效。而且，近年来生物柴油产业发展迅速，其生产过程中产生大 量副产物甘油，如能被合理利用则可以降低生物柴油的生产成本，提高其市场竞争力。因此 以甘油为原料产3-HP契合了生物能源和环保需求，具有良好的社会效益和经济效益，是当 前生物法产3-HP的研宄热点。 以甘油为底物构建基因工程菌根据宿主菌不同主要又包括两大类，一类是在含有 dha操纵子具有甘油脱水酶活性的菌株（如肺炎克雷伯杆菌，Klebsiellapneumoniae)内 引入醛脱氢酶。另一类是在不含甘油脱水酶的菌株（常用的为大肠杆菌，Escherich.coli) 中同时表达甘油脱水酶和醛脱氢酶。如韩国釜山国立大学的Kumar，Ashok等曾分别报道 以K.pneumoniae为出发菌株，引入醛脱氢酶基因构建3-HP合成途径。Jung等则在E.coli 中同时表达甘油脱水酶和醛脱氢酶构建了 3-HP的生产途径，并对宿主进行了多方面改造， 以提高3-HP的产率和转化率。Rathnasingh等对Raj构建的E.coli进行了进一步改造， 并以半醛脱氢酶KGSADH代替醛脱氢酶ALDH后，以提高重组菌产3-HP浓度。Kim也对Kwak等构建的E.coli工程菌进行了进一步的改造，用更高效的半醛脱氢酶PSALDH代替醛脱氢 酶ALDH，重组菌3-HP浓度达到了 57.3g/L。韩国的Chu从Cupriavidusnecator中筛选到 高活性的脱氢酶GabD4,该酶经定向进化后，在E.coli中与甘油脱水酶共表达，最终重组菌 40h产3-羟基丙酸浓度达到了 71. 9g/L。这是目前报道以甘油为底物产3-羟基丙酸的最 高水平。 国内华东理工大学、南京工业大学、江南大学、北京化工大学也有类似的工作报 道，其中北京化工大学田平芳教授研宄团队运用了全局扰动、反义RNA等多种新型生物学 技术手段对K.pneumoniae进行调控，研宄最为深入，但其3-HP产量目前没有大的突破。华 东理工大学的黄艳娜等在K.pneumoniae中表达E.coli的醛脱氢酶ALDH，经优化，微氧条件 下3-HP浓度达到49. 8g/L。这是目前报道重组K.pneumoniae产3-HP的最高水平。 迄今为止构建基因工程菌制备3-羟基丙酸的研宄取得了一定的进展，但是还存 在诸多的问题：1)途径改造本身需要繁琐的分子生物学操作，后期培养往往还需要额外加 入抗生素和诱导剂等，增加操作难度加大生产成本。2)构建工程菌时宿主菌的选择问题。以 K.pneumoniae为宿主，3-HP产生过程中产生大量1，3-丙二醇，后者是K.pneumoniae天然 的终端产物，生成途径很难完全切断，这就使得3-HP浓度和转化率都难以提高。以E.coli 为宿主，3-HP产量相对较高，但由于其自身不具有甘油脱水酶酶活，构建过程更加复杂。而 且E.coli自身不能生成甘油脱水酶的辅酶VB12，需要在发酵体系中额外加入，因其价格昂 贵，从而使得发酵成本大增。3)重组菌中甘油脱水酶和醛脱氢酶的平衡问题也制约了 3-HP 产量的提高。目前发现的甘油脱水酶只在厌氧和微好氧条件下才具活性，而在此条件下 NAD(P)H不能及时的生成醛脱氢酶的辅因子NAD(P) +，这不仅使得3-HP产生速率降低，还会 导致强细胞毒性的3-羟基丙醛积累，从而致使细胞死亡发酵中止。 综上所述，目前本领域需要一种简单有效的工艺能将相对低廉的碳水化合物转化 为3-羟基丙酸，并能获得较高产物浓度和产率，以适应工业化生产的需求。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服了上述现有技术的缺点，提供了一种能够实现的将相对低 廉的甘油利用两种微生物分段、混菌发酵转化为3-羟基丙酸的利用微生物发酵甘油生产 3-羟基丙酸的方法，所述的方法为利用两种微生物进行分段、混菌发酵； 上述两种微生物包括： 具有甘油脱水活性，转化甘油生成3-羟基丙醛或1，3-丙二醇的微生物一； 转化3-羟基丙醛或1，3-丙二醇生成3-羟基丙酸的微生物二； 前段发酵过程条件为含甘油20~120g/L的培养基，接入微生物一的种子培养液， 接种量3~10%，通入空气或氮气，30~42°C，发酵10~45小时，pH为6. 0~8. 0 ; 后段发酵过程条件为在前段培养液中微生物二的种子液或微生物细胞，种子液接 种量为10~20 %，细胞接种量为3~20g/L，通入空气或氧气，20~37°C，培养10~40小 时，pH为 5. 0 ~7. 0 ; 所述的微生物二将1，3-丙二醇或3-羟基丙醛转化生成3-羟基丙酸的相关酶为 膜结合蛋白。优选的，所述的微生物一选自：克雷伯氏肺炎杆菌（Klebsiellapneumoniae)，弗 氏朽1 檬酸杆菌（Citrobacterfreundii), 丁酸梭状芽抱杆菌（Clostridiabutyricum)，巴 氏固氮梭状芽孢杆菌（Clostridiapastruianu)，以及它们的基因工程菌。优选的，所述的微生物二为氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacteroxydans)，以及其 基因工程菌。 优选的，所述的膜结合蛋白以P比略喹啉醌（Pyrroloquinol本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用微生物发酵甘油生产3‑羟基丙酸的方法，其特征在于，所述的方法为利用两种微生物进行分段、混菌发酵；上述两种微生物包括：具有甘油脱水活性，转化甘油生成3‑羟基丙醛或1,3‑丙二醇的微生物一；转化3‑羟基丙醛或1,3‑丙二醇生成3‑羟基丙酸的微生物二；前段发酵过程条件为含甘油20～120g/L的培养基，接入微生物一的种子培养液，接种量3～10％，通入空气或氮气，30～42℃，发酵10～45小时，pH为6.0～8.0；后段发酵过程条件为在前段培养液中微生物二的种子液或微生物细胞，种子液接种量为10～20％或细胞接种量为3～20g/L，通入空气或氧气，20～37℃，培养10～40小时，pH为5.0～7.0；所述的微生物二的转化1，3‑丙二醇或3‑羟基丙醛生成3‑羟基丙酸相关酶为膜结合蛋白。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：赵莉，魏东芝，林金萍，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：上海;31