【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程，尤其是涉及β-葡萄糖苷酶突变体、核酸、基因工程菌及其应用；具体的涉及β-葡萄糖苷酶突变体，编码所述β-葡萄糖苷酶突变体的核酸，含有核酸的重组表达载体和重组表达转化体，重组β-葡萄糖苷酶突变体催化剂，以及重组β-葡萄糖苷酶突变体催化剂在制备糖苷化合物中的应用。
技术介绍
1、β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，ec.3.2.1.21)是一类水解碳水化合物的糖苷键从而释放非还原性末端糖基、糖苷以及低聚糖的酶，主要来源于细菌、真菌、植物及动物体内。其在各种生物体内充当着不同的功能，例如在微生物中可进行生物质转化、糖脂的分解，在植物中可以防御害虫、激活植物激素、细胞壁的分解代谢，在哺乳动物中参与糖脂和膳食纤维的代谢。此外，β-葡萄糖苷酶还广泛应用于各种生物技术过程，由于糖苷酶除了水解糖苷键的作用外还能催化糖苷键的生成，因此它们可以在体内外通过逆水解作用或转糖苷作用合成一系列有价值的糖苷化合物，其中商品化的杏仁β-葡萄糖苷酶常用于各类糖苷的合成(biotechnol lett,1992,14,390-397；carbohydr res,1995,279,315-319)。
2、与微生物来源的β-葡萄糖苷酶相比，植物来源的β-葡萄糖苷酶更能耐受高浓度葡萄糖的抑制，而在糖苷的酶促合成反应中正是需要这种能耐受高浓度糖的糖苷酶。根据氨基酸的序列相似性，可将植物β-葡萄糖苷酶划分为gh1、gh3、gh5、gh7、gh9、gh12、gh35和gh116等8个家族。目前直接从植物体内分离纯化大量的β-葡萄糖苷
3、原核表达系统由于缺乏翻译后修饰功能导致所得蛋白往往不具有活性，而毕赤酵母(pichia pastoris)是目前继大肠杆菌(escherichia coli)之后最常用的真核表达系统，可以在实验室和工业规模表达数千种蛋白质，同时可作为细胞工厂广泛用于一系列化学品的生产。该系统由于其功能强大，并且可以以甲醇作为唯一碳源来生产蛋白，与其它动物或哺乳细胞相比，该系统无需复杂的生长环境，分子遗传操作技术简单，并且具有真核蛋白合成(eukaryotic protein synthesis，eps)路径(yeast,2005,22,249-270)。
4、目前研究较为广泛的β-葡萄糖苷酶主要来源于微生物，但大部分微生物β-葡萄糖苷酶易受高浓度葡萄糖的抑制无法满足糖苷的酶促合成需求。而植物种子作为耐高浓度葡萄糖糖苷酶的主要来源之一，由于真核生物异源表达困难这一问题限制了其主要应用，因此亟需构建多样化且易规模化生产的表达系统，来简化植物β-葡萄糖苷酶的分离纯化工艺。
技术实现思路
1、植物糖苷酶异源表达困难且通常需要经过表达后的糖基化修饰，而大部分菌种没有类似功能，因此缺乏能高效合成糖苷化合物的生物催化剂。针对这一问题，本专利技术提供β-葡萄糖苷酶突变体、核酸、基因工程菌及其应用。
2、具体地，本专利技术选择对对羟基苯乙醇-β-d-葡萄糖苷具有合成活性的苹果籽粉作为研究目标，挖掘其中起关键糖苷合成作用的β-葡萄糖苷酶，以食品安全菌株毕赤酵母作为表达宿主，通过对毕赤酵母表达系统和β-葡萄糖苷酶序列进行改造，提供一种具有高表达水平的β-葡萄糖苷酶突变体，编码所述β-葡萄糖苷酶突变体的核酸，含有核酸的重组表达载体和重组表达转化体，重组β-葡萄糖苷酶突变体催化剂，以及重组β-葡萄糖苷酶突变体催化剂在制备糖苷化合物中的应用。
3、本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：
4、本专利技术的技术方案之一是：提供一种β-葡萄糖苷酶突变体，即提供一种可以作为β-葡萄糖苷酶的分离的蛋白质，其是将如seq id no.4所示的氨基酸序列中的第54位his、第80位val、第329位ala、第353位thr、第355位thr、第435位ile、第454位glu中的一个或多个氨基酸残基替换为其它氨基酸残基所形成的新氨基酸序列。
5、优选地，β-葡萄糖苷酶突变体的氨基酸序列为如下的一种：
6、(1)将如seq id no.4所示氨基酸序列的第54位his替换为pro；
7、(2)将如seq id no.4所示氨基酸序列的第80位val替换为ala；
8、(3)将如seq id no.4所示氨基酸序列的第329位ala替换为asp；
9、(4)将如seq id no.4所示氨基酸序列的第353位thr替换为ser；
10、(5)将如seq id no.4所示氨基酸序列的第355位thr替换为pro；
11、(6)将如seq id no.4所示氨基酸序列的第435位ile替换为thr；
12、(7)将如seq id no.4所示氨基酸序列的第454位glu替换为ala；
13、(8)将如seq id no.4所示氨基酸序列的第80位val替换为ala，第329位ala替换为asp；
14、(9)将如seq id no.4所示氨基酸序列的第80位val替换为ala，第435位ile替换为thr；
15、(10)将如seq id no.4所示氨基酸序列的第80位val替换为ala，第454位glu替换为ala；
16、(11)将如seq id no.4所示氨基酸序列的第435位ile替换为thr，第454位glu替换为ala；
17、(12)将如seq id no.4所示氨基酸序列的第80位val替换为ala，第329位ala替换为asp，第435位ile替换为thr；
18、(13)将如seq id no.4所示氨基酸序列的第80位val替换为ala，第435位ile替换为thr，第454位glu替换为ala。
19、其中，如seq id no.4所示的氨基酸序列对应的β-葡萄糖苷酶为苹果籽来源的β-葡萄糖苷酶。
20、本专利技术所述蛋白质的制备方法为本领域常规制备方法。
21、所述制备方法较佳地为：将编码所述蛋白质并且带有点突变的核酸分子克隆到表达载体，将所得重组质粒线性化后转化至表达宿主中，得到重组表达转化体；培养所得的重组表达转化体，分离纯化获得所述的蛋白质。
22、本专利技术所述蛋白质的制备方法也可以通过人工合成蛋白质的序列获得。
23、本专利技术的技术方案之二本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种β-葡萄糖苷酶突变体，其特征在于，β-葡萄糖苷酶突变体的氨基酸序列为如下的一种：
2.编码权利要求1所述β-葡萄糖苷酶突变体的核酸。
3.包含权利要求2所述编码所述β-葡萄糖苷酶突变体的核酸的重组表达载体。
4.包含权利要求2所述编码所述β-葡萄糖苷酶突变体的核酸或权利要求3所述重组表达载体的重组表达转化体。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达转化体为一种毕赤酵母基因工程菌，所述毕赤酵母基因工程菌基因组上整合有表达盒，所述表达盒包含AOX1启动子、Kozak、修饰后的α-factor信号肽和氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的β-葡萄糖苷酶或如权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶突变体。
6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，所述AOX1启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，Kozak的核苷酸序列为aaaaca，修饰后的α-factor信号肽氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；
7.一种重组β-葡萄糖苷酶突变体催化剂，其特征在于，培养权利要求4-6中
8.权利要求1所述β-葡萄糖苷酶突变体或权利要求7所述重组β-葡萄糖苷酶突变体催化剂在合成糖苷化合物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，在含有磷酸盐缓冲液的有机溶剂中，在葡萄糖和羟基酚存在的条件下，利用权利要求1所述β-葡萄糖苷酶突变体或权利要求7所述重组β-葡萄糖苷酶突变体催化剂进行逆水解反应，制得相应β-D-葡萄糖苷；
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，在含有磷酸盐缓冲液的有机溶剂中，所述葡萄糖在反应液中的浓度为0.1～0.5mol/L；所述羟基酚在反应液中的浓度为1～5mol/L；所述有机溶剂为叔丁醇或二氧六环；权利要求1所述β-葡萄糖苷酶突变体或权利要求7所述重组β-葡萄糖苷酶突变体催化剂的用量为300～4000U/mol羟基酚；所述逆水解反应的温度为40～70℃。
...【技术特征摘要】
1.一种β-葡萄糖苷酶突变体，其特征在于，β-葡萄糖苷酶突变体的氨基酸序列为如下的一种：
2.编码权利要求1所述β-葡萄糖苷酶突变体的核酸。
3.包含权利要求2所述编码所述β-葡萄糖苷酶突变体的核酸的重组表达载体。
4.包含权利要求2所述编码所述β-葡萄糖苷酶突变体的核酸或权利要求3所述重组表达载体的重组表达转化体。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达转化体为一种毕赤酵母基因工程菌，所述毕赤酵母基因工程菌基因组上整合有表达盒，所述表达盒包含aox1启动子、kozak、修饰后的α-factor信号肽和氨基酸序列如seq id no.4所示的β-葡萄糖苷酶或如权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶突变体。
6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，所述aox1启动子的核苷酸序列如seq id no.1所示，kozak的核苷酸序列为aaaaca，修饰后的α-factor信号肽氨基酸序列如seq id no.2所示；
【专利技术属性】
技术研发人员：郁惠蕾，陆馨怡，赖铭元，秦鹏，张志钧，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：
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