制备2,4-二羟基丁酸盐的方法技术

本发明专利技术涉及一种从高丝氨酸制备2,4-二羟基丁酸的方法，其包括第一步，将高丝氨酸的伯氨基转化为羰基以获得2-氧代-4-羟基丁酸盐和第二步，将所获得的2-氧代-4-羟基丁酸盐(OHB)还原为2,4-二羟基丁酸盐。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种从高丝氨酸制备2,4-二羟基丁酸盐(2,4-DHB)的新方法，其包括两个步骤：-第一步，将高丝氨酸的伯氨基转化为羰基以获得2-氧代-4-羟基丁酸盐，和-第二步，将获得的2-氧代-4-羟基丁酸盐(OHB)还原以获得2,4-DHB。本专利技术所述的羧酸依据盐形式(例如2,4-二羟基丁酸盐，2,4-dihydroxyburyrate)命名或依据酸形式(例如2,4-二羟基丁酸，2,4-dihydroxybutyric acid)的命名的含义等同。
技术介绍
2,4-二羟基丁酸(等同于2,4-DHB或DHB)是经济价值可观的化合物。通过调节适宜的pH，可以在含水介质中将DHB转化为α-羟基-γ-丁内酯。α-羟基-γ-丁内酯是制备蛋氨酸代替品2-羟基-4-(甲硫基)-丁酸(HMTB)(US2009/318715)的主要前体，其具有较大的动物营养品市场。目前，α-羟基-γ-丁内酯通过多步骤方法从γ-丁内酯衍生而来，所述多步骤方法意味着在γ-丁内酯的α位卤化并随后在碱性介质中通过羟基取代卤原子(US2009/318715)。油价的上涨提高了从可再生资源制备DHB的需要。微生物能够将生物质衍生的原材料，例如糖或有机酸转化为很多种不同的化合物(Werpy&Petersen，2004)。随着生物化学体和基因信息的增长，有可能将微生物改性，使其以高产量和产率，过量生产天然产生的代谢中间产物(Bailey,1991)。微生物制备的优化通常需要代谢网的合理构化，其确保了在其他成员中意向代谢物生物合成所需的酶的过度表达，产品反馈抑制的缓和。另一种可能是植入新的酶体系，催化意向代谢物的生产。构化代谢的方法和酶催化需要生物化学的详细知识和产生意向代谢物的代谢途径的规划。就生产DHB而言，并不具备上述信息。仅极少的研究报道了在缺乏琥珀酸半醛脱氢酶的患者中产生DHB(Shinka等，2002)，但是并未确定在生产DHB中涉及的酶反应。因此，DHB的发酵或酶生产，需要(i)确定热力学上可行的途径，其将可以获得的前体转化为DHB，(ii)确定或构建在所述途径中能够催化每个反应步骤的酶和(iii)在适宜的制备生物中途径酶的功能表达。本专利技术的目的在于满足这些需要。
技术实现思路
因此，本专利技术的目的之一在于从高丝氨酸制备2,4-DHB的方法，其包括两个步骤(见图1)：-第一步，将高丝氨酸的伯氨基转化为羰基以获得OHB，和-第二步，将所获得的OHB还原为2,4-DHB。本专利技术的方法的第一步和/或第二步可以通过用内源基因或外源基因编码的酶来催化。在说明书中，也可以通过参照编码具有所述活性的酶的基因指定酶的活性。所用基因的类别并不限于特定的生物，但是覆盖了其他生物(例如微生物、功能等价物、功能变体及其功能片段，只要所述生物保存了酶的活性)中所有对应的基因和蛋白质。就本专利技术的另一方面而言，将高丝氨酸的伯氨基转化为羰基以获得OHB的酶可以是高丝氨酸转氨酶、高丝氨酸脱氢酶或高丝氨酸氧化酶。就本专利技术的另一方面而言，可以在具有天冬氨酸转氨酶(EC2.6.1.1)活性、支链氨基酸转氨酶(EC2.6.1.42)活性或芳香氨基酸转氨酶(EC2.6.1.57)活性的酶中识别具有高丝氨酸转氨酶活性的酶。就本专利技术的另一方面而言，所述高丝氨酸转氨酶可以是来自大肠杆菌、Ec-llvE和乳酸链球菌和Ll-BcaT的支链氨基酸转氨酶，和来自大肠杆菌、Ec-TyrB、乳酸链球菌、Ll-AraT和酿酒酵母、Sc-Aro8的芳香族氨基酸转氨酶，或来自大肠杆菌、Ec-AspC的天冬氨酸转氨酶。本专利技术的第二步通过具有OHB还原酶活性的酶催化。本专利技术的另一方面在于，具有OHB还原酶活性的酶可以在具有2-羟基酸脱氢酶活性的酶中确定，特别是具有乳酸脱氢酶(Ldh)(EC1.1.1.27、EC1.1.1.28)、苹果酸脱氢酶(Mdh)(EC1.1.1.37、EC1.1.1.82、EC1.1.1.299)活性的酶，或支链(D)-2-羟基酸脱氢酶(EC1.1.1.272、EC1.1.1.345)活性的酶中确定。更特别地，具有高丝氨酸转氨酶活性的酶是通过基因ilvE、tyrB、aspC、araT、bcaT、或AR08编码。就甚至更特定的方面而言，具有高丝氨酸转氨酶活性的酶通过SEQ ID No.59、SEQ ID No.61、SEQ ID No.63、SEQ ID No.65、SEQ ID No.67或SEQ ID No.69或与所述序列至少50％同源的任意序列或对应SEQ ID No.60、SEQ ID No.62、SEQ ID No.64、SEQ ID No.66、SEQ ID No.68、SEQ ID No.70或与所述序列至少50％同源的任意序列所编码。就本专利技术的另一方面而言，所述OHB还原酶可以是来自乳酸链球菌(Ll-LdhA)、穴兔(Oc-LldhA)、嗜热脂肪土芽孢杆菌(Gs-Lldh)、或枯草杆菌(Bs-Ldh)的(L)-乳酸脱氢酶，来自大肠杆菌(Ec-LdhA)的(D)-乳酸脱氢酶，来自大肠杆菌(Ec-Mdh)的(L)-苹果酸脱氢酶或来自乳酸链球菌(Ll-PanE)的支链(D)-2-羟基酸脱氢酶。就本专利技术的甚至更特定的方面而言，所述OHB还原酶表示为以下氨基酸序列SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、SEQ ID No.10、SEQ ID No.12、SEQ ID No.14、SEQ ID No.288、SEQ ID No.30、SEQ ID No.32、SEQ ID No.102、SEQ ID No.104,SEQ ID No.106,、SEQ ID No.108、SEQ ID No.110、SEQ ID No.112、SEQ ID No.114、SEQ ID No.116或SEQ ID No.118或与所述序列至少50％同源的任意序列，或通过以下核酸序列编码：SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.11、SEQ ID No.13、SEQ ID No.287、SEQ ID No.29、SEQ ID No.31、SEQ ID No.101、SEQ ID No.103、SEQ ID No.105、SEQ ID No.107、SEQ ID No.109、SEQ ID No.1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从高丝氨酸制备2,4‑二羟基丁酸盐(等同于2,4‑二羟基丁酸)的方法，其包括两个步骤：‑第一步，将高丝氨酸的伯氨基转化为羰基以获得2‑氧代‑4‑羟基丁酸盐，和‑第二步，将所获得的2‑氧代‑4‑羟基丁酸盐(OHB)还原为2,4‑二羟基丁酸盐。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.07.11 US 61/670,4051.一种从高丝氨酸制备2,4-二羟基丁酸盐(等同于2,4-二羟基丁酸)
的方法，其包括两个步骤：
-第一步，将高丝氨酸的伯氨基转化为羰基以获得2-氧代-4-羟基丁酸
盐，和
-第二步，将所获得的2-氧代-4-羟基丁酸盐(OHB)还原为2,4-二羟
基丁酸盐。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一步和/或第二步通过内
源基因或外源基因编码的酶来催化。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一步分别通过具有
高丝氨酸转氨酶、高丝氨酸脱氢酶或高丝氨酸氧化酶活性的酶催化。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述具有高丝氨酸转氨酶活性
的酶是通过基因ilvE、tyrB、aspC、araT、bcaT、ARO8编码。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述具有高丝氨酸转氨酶活性
的酶是通过SEQ ID No.59、SEQ ID No.61、SEQ ID No.63、SEQ ID No.65、
SEQ ID No.67或SEQ ID No.69或与所述序列至少50％同源的任意序列编
码或对应SEQ ID No.60、SEQ ID No.62、SEQ ID No.64、SEQ ID No.66、
SEQ ID No.68、SEQ ID No.70或与所述序列至少50％同源的任意序列所
编码。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第二步通过具有OHB
还原酶活性的酶催化。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述具有OHB还原活性的酶是
乳酸脱氢酶、或苹果酸脱氢酶、或支链2-羟基酸脱氢酶。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述OHB还原酶是来自大
肠杆菌的(D)-乳酸脱氢酶、来自乳酸链球菌、穴兔、嗜热脂肪土芽孢杆菌、
或枯草杆菌的(L)-乳酸脱氢酶、来自大肠杆菌的(L)-苹果酸脱氢酶、来自
乳酸链球菌的支链(D)-2-羟基酸脱氢酶或其同系物。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述OHB还原酶是
-乳酸脱氢酶，其包括在位置V17、Q85、E89、I226或A222有至少
一个突变，所述位置参照乳酸链球菌乳酸脱氢酶(SEQ.ID No.6)定义
-苹果酸脱氢酶，其包括在位置I12、R81、M85、D86、V93、G179、
T211或M227有至少一个突变，所述位置参照大肠杆菌苹果酸脱氢酶
(SEQ ID No.2)定义。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述OHB还原酶
-通过SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、SEQ 
ID No.10、SEQ ID No.12、SEQ ID No.14、SEQ ID No.288、SEQ ID No.30、
SEQ ID No.32、SEQ ID No.102、SEQ ID No.104、SEQ ID No.106、SEQ ID 
No.108、SEQ ID No.110、SEQ ID No.112、SEQ ID No.114、SEQ ID No.116
或SEQ ID No.118所表示或通过与所述序列至少50％同源的任意序列所
表示
-通过核酸编码，所述核酸通过序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ 
ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.11、SEQ ID No.13、
SEQ ID No.287、SEQ ID No.29、SEQ ID No.31、SEQ ID No.101、SEQ ID 
No.103、SEQ ID No....

【专利技术属性】
技术研发人员：托马斯·瓦尔特，伊莲娜·科迪尔，克莱芒蒂娜·德雷赛尔，让玛丽·弗朗索瓦，罗伯特·胡艾特，
申请(专利权)人：安迪苏法国联合股份有限公司，
类型：发明
国别省市：法国;FR