一种微生物转化的方法技术

本发明专利技术涉及采用普罗维登斯菌属微生物转化L-酪氨酸生产R-(+)-3-(4-羟基苯基)-2-羟基丙酸。该方法过程简单，具有重要的工业应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术采用普罗维登斯菌转化L-酪氨酸生产D-4-羟基苯乳酸，属于工业微生物领域。
技术介绍
D-4-羟基苯乳酸，又名对羟基苯乳酸，学名为R-(+)-3-(4-羟基苯基)-2-羟基丙酸，英文名为：D-4-hydroxyphenyllacticacid、D-p-Hydroxyphenyllacticacid，R-(+)-2-hydroxy-3-(4-hydroxyphenyl)propanoicacid。4-羟基苯乳酸是乳酸菌发酵过程中产生的除苯乳酸外的另一种广谱、低毒的生物防腐剂，当前主要通过乳酸菌生成(中国专利CN200810244053.2)。4-羟基苯乳酸是乳酸菌发酵过程中产生的除苯乳酸外的另一种广谱、低毒的生物防腐剂，当前主要通过乳酸菌生成(中国专利CN200810244053.2)。有也文献表明，普通变形杆菌(Proteusvulgaris)可将L-酪氨酸转化成D-4-羟基苯乳酸(Theinfluenceofconditionsofbacterialcleavageofproteinsonthecleavageproducts,1917,J.Biol.Chem.527-532)。基于D-4-羟基苯乳酸的重要应用价值，本专利提出了普罗维登斯菌属微生物转化L-酪氨酸生产D-4-羟基苯乳酸的方案。L-酪氨酸当前主要通过微生物发酵法生产，原料丰富易得。普罗维登斯菌(Providencia)是一类可使苯丙氨酸氧化脱氨的革兰氏阴性细菌。现有主要8个种：产碱普罗威登斯菌(Providenciaalcalifaciens)、斯氏普罗威登斯菌(Providenciastuartii)、雷极普罗威登斯菌(Providenciarettgeri)、害虫普罗威登斯菌(Providenciavermicola)、Providenciasneebia、Providenciaburhodogranariea。普罗维登斯菌具有强大的氧化脱氨能力(SherrisMedicalMicrobiology，2004，4thed.)，L-酪氨酸可以被普罗维登斯菌氧化脱氨成4-羟基苯丙酮酸，然后再还原成D-4-羟基苯乳酸。4-羟基苯丙酮酸虽然是更为直接的底物，但价格昂贵且不稳定，因此L-酪氨酸是最佳的底物。普罗维登斯菌是一种兼性厌氧菌，可以在厌氧条件或好氧条件下转化生产D-4-羟基苯乳酸，具有高转化率和高纯度的特点。
技术实现思路
本专利技术通过培养普罗维登斯菌属微生物菌体，转化L-酪氨酸生产D-4-羟基苯乳酸，技术方案如下：1、菌株本专利技术所用的菌株有购自美国ATCC菌种库的ProvidenciaalcalifaciensATCC9886、ProvidenciarustigianiiATCC33673、ProvidenciasneebiaATCCBAA-1589、ProvidenciarettgeriATCC29944、ProvidenciaheimbachaeATCC35613、ProvidenciastuartiiATCC33672、ProvidenciaburhodogranarieaATCCBAA-1590以及购自中国工业微生物菌种保藏管理中心的ProvidenciarettgeriCICC10488和中国典型培养物保藏中心的ProvidenciavermicolaCCTCCAB205297。2、菌体培养液态发酵培养基组成为：碳源0-50g/L，氮源0-50g/L，磷酸氢二铵0-2g/L，磷酸二氢钾0-1g/L，硫酸镁0-0.5g/L，硫酸亚铁0-0.5g/L，氯化纳0-5g/L，可调节pH至2-8，可也pH自然；接种量为5-20％，发酵温度为20-40℃，发酵周期为24-72小时。种子和发酵均采用此培养基。用于培养菌种的碳源可以是葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖、蔗糖、半乳糖、甘油。培养用氮源可以是硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、蛋白胨、酵母膏、尿素、玉米浆等有机氮源。碳源和氮源可以是一种或多种的组合。液态培养菌体的过程可以采用厌氧或好氧方式。3、转化产D-4-羟基苯乳酸转化过程采用的方案有2种：(1)细胞的液态培养过程，将L-酪氨酸底物加入上述的培养体系中；L-酪氨酸添加量为0-0.3g/L。(2)将液态发酵培养物离心去除发酵液得到菌体，将菌体放入含有L-酪氨酸底物的水溶液反应体系中进行；转化过程温度20-40℃，pH2-8，转化时间1-24小时。转化液中L-酪氨酸起始浓度为0.1-0.3g/L。4、样品的检测分析转化液采用PerkinElmerSeries200高效液相色谱仪检测分析，色谱条件为：流动相是甲醇-0.1％甲酸水(40:60)、采用汉邦MegresC18色谱柱(4.6×250mm，5μm)，流速0.6ml/min、柱温30℃、进样量20μl、检测器波长200nm。采用江苏汉邦科技有限公司的DAC-HB50制备色谱柱制备转化样品，制备色谱条件为：流动相50％甲醇、柱温自然、流速3ml/min、进样量5ml。样品达到色谱纯99.9％，反复进样分离得到的产品于50℃下真空旋转蒸干。称取制备得到的样品0.5g，溶于去甲醇中并定容至50ml，采用日本爱宕AP-300全自动旋光仪测定放光度。进一步采VarianGemini2000(VnmrS600MHz,600/54/ASP)分析样品的核磁数据。样品进一步采用UPLC-QTOF-MS法分析分子量，仪器为WatersMALDISYNAPTQTOFMS液相色谱串联四极杆飞行时间质谱仪。具体实施方式实施例1转化产物的分析测定。配制培养基如下：酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L。500ml三角瓶中装液量为100ml，共50瓶，120℃，20分钟灭菌。取ProvidenciarustigianiiATCC33673甘油管种子液1mL接种，发酵温度30℃，摇床转速200rpm。培养24后，将发酵液离心(转速10000rpm，时间10min)，去除上清液获得菌体，离心获得的菌体用无菌水清洗两遍。取20g湿菌体放入L-酪氨酸浓度为0.3g/L的10000ml溶液中，混合均匀。于37℃摇床振荡(100rpm)24小时后，100℃水浴加热3分钟杀灭菌体。再离心(转速10000rpm，时间10min)去除菌体，得到转化后的上清液。液相分析D-4-羟基苯乳酸浓度为0.15g/L，剩余L-酪氨酸浓度为0.11g/L。采用制备色谱得到本文档来自技高网...

【技术保护点】
普罗维登斯菌属微生物转化L‑酪氨酸生产R‑(+)‑3‑(4‑羟基苯基)‑2‑羟基丙酸，具体的微生物有：产碱普罗威登斯菌、斯氏普罗威登斯菌、雷极普罗威登斯菌、害虫普罗威登斯菌、Providencia sneebia、Providencia burhodogranariea。

【技术特征摘要】
1.普罗维登斯菌属微生物转化L-酪氨酸生产R-(+)-3-(4-羟基苯基)-2-羟基丙
酸，具体的微生物有：产碱普罗威登斯菌、斯氏普罗威登斯菌、雷极普
罗威登斯菌、害虫普罗威登斯菌、Providenciasneebia、Providencia
burhodogranariea。
2.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡宇杰，陈丽霞，邓华祥，陈佳君，钟妮尔，王静，白亚军，郑晓晖，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32