一种利用微生物转化制备人参皂苷Rd的方法技术

本发明专利技术属于生物医药技术领域，涉及一种利用微生物转化制备人参皂苷Rd的方法，具体涉及一种黑曲霉发酵转化各种二醇型人参皂苷，制备人参皂苷Rd的微生物转化的方法。本方法中，采用一株高转化的工业黑曲霉，菌种保藏号CICC40426，在全自动发酵罐中，发酵转化各种二醇型人参皂苷，并通过大孔树脂纯化和结晶，制备高纯度人参皂苷Rd。本发明专利技术工艺简单、成本低、收率高，且绿色环保；本发明专利技术方法能实现人参皂苷Rd的产业化制备，扩充人参皂苷Rd药物资源来源，满足广阔的医疗保健的市场需要，具有极大价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药
，涉及，具体涉及一种用黑曲霉发酵转化各种二醇型人参皂苷制备人参皂苷Rd的微生物转化的方法。
技术介绍
人参(Panax ginseng C. A. Meyer)是我国传统的名贵中药材,化学成分复杂,生物活性广泛，药理作用独特。随着现代分离和分析技术的进步，人参中的化学成分得到了进一步的阐明，人参皂苷是这些分离的组分中主要的生物活性物质，到目前为止，已分离鉴定的人参皂苷单体有50余种。有研究公开了有关人参皂甙Rd已经通过中山大学医学院关永源实验证实可作为 一种新型钙离子拮抗药物，该人参皂甙Rd可通过血管平滑肌细胞受体介导(ROCC)和钙池调控(SOCC)钙离子通道途径显著的特异性抑制Ca2+内流，然而对血管平滑肌细胞电压依赖的钙离子通道(VDCC)和Ca2+释放未见明显作用。动物实验还表明，该Rd能明显抑制高血压脑血管重构，降低SHRSP大鼠中风率及死亡率，保护脑细胞。上述研究结果同时也提示了人参皂苷Rd新药一旦开发成功用于急性缺血性脑卒中病的治疗具有非常大的市场空间。目前，国内广东泰禾医药科技有限公司已经开发Rd注射液作为治疗脑中风新药，并进入了 III期临床试验总结阶段，但其中的药用来源的Rd主要从天然的人参总皂苷中直接提取；众所周知的原因，由于天然Rd含量非常稀少，获取渠道单一，因此其市场价格十分昂虫贝ο本领域公知，所述的人参皂苷Rd在人参中含量较低，只有O. 2%左右，因其结构复杂，化学合成该人参皂苷Rd至今尚未成功；有研究从人参、三七等植物根、茎、叶中提取获得Rd单体，由于其提取方法收率低，成本较高，明显影响了医疗保健市场需求的进一步扩大，因此有必要开发一种产率高，纯度好，并且简单易行的制取人参皂苷Rd的方法。目前，有研究试图利用加化学方法将主要皂苷转化为活性更高的稀有皂苷，但是上述化学方法中水解条件较剧烈，不易控制，且在水解过程中常使皂苷元发生脱水、环合、差向异构、羟化等反应，产生较多副产物，很难得到目标产物；而由于生物转化的区域和立体选择性强、反应条件温和，使得本领域研究者青睐于采用酶转化法和微生物转化法制备稀有人参皂苷；但所获得的人参皂苷Rd及其转化过程中仍存在如下述的缺陷与不足Kim M. M等筛选了一株 β-糖苷酶高表达的菌株Sphingomonas echinoides GP50,并利用其转化人参皂苷Rb I制备Rd，但转化率仅为65 %。CN200810200086. 7公开了运用底物耐受诱变获得了一株高耐受、高转化的拟青霉菌Paecilomyces sp. 4685,通过条件优化转化率达到85%，投料量最大为2%，但只局限于摇瓶工艺。Ye L.等通过LiCl诱变获得一株高转化菌株Paecilomyces Bainier sp. 229-7,进行了 6L发酵,转化率可以达到90%,但最终获得的产品的纯度仅为92%。因此，目前迫切需要一种工艺简单、成本低、收率高、且绿色环保的制取人参皂苷Rd的方法。与本专利技术有关的参考文献有 Sanada S，Kondo N，Sgoji J，et al. Studies on the saponins of ginseng，IStructure of ginsenoside Ro, Rb, Rb I, Rd. Chem Pharm Bull，1974，22 :421-428. Sanada S，Kondo N，Sgoji J，et al. Studies on the saponins of ginseng，IStructure of ginsenoside Re，Rf，Rg· Chem Pharm Bull，1974，22，2407-2412. Yahara S， Tanaka 0.and Komori T.Saponin of leaves of Panax ginsengC. A. Meyer. Chem Pharm Bull，1976，24 :2204-2208.Guan Y. Y.，Zhou J. G.，Zhang Z.，et al. Ginsenoside-Rd from panax notoginsengblocks Ca2+influx through receptor-and store-operated Ca2+channels in vascularsmooth muscle cellsEuropean. Journal of Pharmacology，2006，548 :129-136. Zhou J. G.，Qiu Q. Y.，Zhang Z.，et al. Evidence for capacitative andnon-capacitative Ca2+entry pathways coexist in AlO vascular smooth musclecells. Life Sciences，2006，78 :1558-1563Kim Μ. M. ,Lee J. W. ,Lee Κ. Y.，et al. Microbial conversion of major ginsenosideRbl to pharmaceuticalIy active minor ginsenoside Rd. The Journal ofMicrobiology,2005,43 :456-462. 周珮，史训龙，冯美卿等..CN200810200086. 7，2008-9-18.Ye L.，Zhou C. Q，Zhou W.，et al. Biotransformation of ginsenoside Rbl toginsenoside Rd by highly substrate-tolerant Paecilomyces bainier 229-7.Bioresource Technology，2010，101 :7872_78760
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的缺陷和不足，提供，具体涉及一种用黑曲霉发酵转化各种二醇型人参皂苷制备人参皂苷Rd的微生物转化的方法；该方法可简便、高效、环保、规模化制备高纯度人参皂苷Rd。本专利技术方法中，采用高转化的工业黑曲霉，在全自动发酵罐中，发酵转化各种二醇型人参皂苷，通过大孔树脂纯化和结晶，制备高纯度人参皂苷Rd;本专利技术方法中所采用的黑曲霉为由中国微生物菌种保藏管理委员会工业微生物保藏中心保藏的黑曲霉(Aspergillus niger)，菌种保藏号 CICC40426。具体而言，本专利技术的利用微生物转化制备人参皂苷Rd的方法，其特征在于，其包括步骤(I)将筛选的黑曲霉(Aspergillus niger，菌种保藏号CICC40426)置于发酵培养基中，培养后；(2)采用流加方式添加二醇型人参皂苷于全自动发酵罐中，进行发酵转化；(3)添加大孔树脂于全自动发酵罐中，富集产物；(4)采用HP20SS大孔树脂进行柱层析纯化，制得人参皂苷Rd ；(5)采用结晶方法对步骤⑷制得的人参皂苷Rd进行纯化，制得高纯度人参皂苷Rdo本专利技术中，所述步骤(I)的发酵培养基为以麸皮、蔗糖、葡萄糖、淀粉之中的一种或几种培养基作为碳源，以酵母粉、蛋白胨及黄豆粉本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用微生物转化制备人参皂苷Rd的方法，其特征在于，采用黑曲霉菌株，在全自动发酵罐中，发酵转化各种二醇型人参皂苷，通过大孔树脂纯化和结晶，制备高纯度人参皂苷Rd；其包括步骤：(1)将黑曲霉(Aspergillus？niger，菌种保藏号CICC40426)置于发酵培养基中，培养；(2)采用流加方式添加二醇型人参皂苷于全自动发酵罐中，进行发酵转化；(3)添加大孔树脂于全自动发酵罐中，富集产物；(4)采用HP20ss大孔树脂进行柱层析纯化，制得人参皂苷Rd；(5)采用结晶方法对步骤(4)制得的人参皂苷Rd进行纯化，制得高纯度人参皂苷Rd。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：周珮，史训龙，周伟，冯美卿，李继扬，叶丽，周超群，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：