重组微生物和其使用方法技术
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本申请要求2013年9月12日提交的临时申请号61/877,272的优先权，该临时申请的内容特此以引用的方式并入。
本专利技术涉及用于制备重组梭菌属(Clostridiumspp)的选择标记。
技术介绍
用于制造重组生物体的方法是已知的。所述方法通常包括用外源核酸载体转化生物体，所述外源核酸载体可与宿主基因组整合或保持在稳定的独立(例如，染色体外)状态。将外源核酸整合至宿主基因组中涉及载体与内源核酸之间的双交叉事件。双交叉重组在过低的频率下发生以致于不能仅靠偶然来可靠地鉴定整合体。因此，选择一个或两个交叉的方法在时间和劳力上都对鉴定频率具有巨大益处。用于筛选重组事件的选择标记是已知的。这些标记通常是赋予宿主生物体以选择性优点(正向选择)或缺点(反向选择)的蛋白质编码序列。多种正向选择和反向选择标记是已知的并且可以用于筛选其中已发生所希望的重组事件的生物体。正向选择标记通常包含当表达时允许生物体在特定生长环境中存活的基因。反向选择标记通常包含当表达时产生对生物体致命的毒素的基因。在除梭菌之外的细菌中，存在过多的可用反向选择标记，但不幸的是由于生理或遗传原因，绝大多数在梭菌中不起作用。本专利技术的一个目的是克服现有技术的一个或多个缺点，或至少向公众提供有用的选择。
技术实现思路
在第一方面，本专利技术提供ThiK和/或PheS在从亲本微生物产生重组微生物的方法中作为反向选择标记的用...
【技术保护点】
一种ThiK和/或PheS在从亲本微生物产生重组微生物的方法中作为反向选择标记的用途，其中所述亲本微生物是梭菌属，并且其中所述PheS相比于野生型PheS包括至少一个变异以使得在使用中苯丙氨酸tRNA合成酶能够使用苯丙氨酸类似物来氨基酰化tRNA。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.09.12 US 61/877,2721.一种ThiK和/或PheS在从亲本微生物产生重组微生物的方法中作为反向选择标记的
用途，其中所述亲本微生物是梭菌属，并且其中所述PheS相比于野生型PheS包括至少一个
变异以使得在使用中苯丙氨酸tRNA合成酶能够使用苯丙氨酸类似物来氨基酰化tRNA。
2.一种编码ThiK和/或PheS的核酸在用于从亲本微生物产生重组微生物的质粒中的用
途，其中所述亲本微生物是梭菌属，并且其中所述PheS相比于野生型PheS包括至少一个变
异以使得在使用中苯丙氨酸tRNA合成酶能够使用苯丙氨酸类似物来氨基酰化tRNA。
3.一种包含编码ThiK和/或PheS的核酸的质粒用于从亲本微生物产生重组微生物的用
途，其中所述亲本微生物是梭菌属，并且其中所述PheS相比于野生型PheS包括至少一个变
异以使得在使用中苯丙氨酸tRNA合成酶能够使用苯丙氨酸类似物来氨基酰化tRNA。
4.一种用于从亲本微生物产生重组微生物的方法，所述方法包括至少以下步骤：
a)用质粒转化亲本微生物，所述质粒包含：
1.编码选自PheS和ThiK的至少一个反向选择标记的至少一个核酸序列，其中所述PheS
相比于野生型PheS包括至少一个变异以使得在使用中苯丙氨酸tRNA合成酶能够使用苯丙
氨酸类似物来氨基酰化tRNA；
2.编码至少一个正向选择标记的至少一个核酸序列；和
3.与所述亲本微生物的基因组内的目标位置周围的所选区域同源的两个核酸序列，其
允许所述质粒与所述亲本微生物的基因组重组；
b)选择表达所述至少一个正向选择标记的一种或多种微生物；和
c)选择不表达所述至少一个反向选择标记的一种或多种微生物。
5.如权利要求4所述的方法，其中选择步骤b)和c)是同时或依序进行的。
6.如权利要求4或5所述的方法，其中所述质粒还包含有待插入亲本基因组中的至少一
个所关注核酸序列。
7.如权利要求1至3中的任一项所述的用途或如权利要求4至6中的任一项所述的方法，
其中PheS中的至少一个变异位于底物特异性位点内。
8.如权利要求7所述的用途或方法，其中所述底物特异性位点位于相对于合成气发酵
梭菌的野生型PheS(SEQIDNo.21)的氨基酸位置读取的氨基酸306与313之间。
9.如权利要求8所述的用途或方法，其中所述至少一个变异是在位置311处的氨基酸取
代。
10.如权利要求9所述的用途或方法，其中所述位置311处的取代是用Cys取代Gly。
11.如权利要求10所述的用途或方法，其中包括至少一个变异的所述PheS包含SEQID
53的氨基酸序列。
12.一种编码P...
【专利技术属性】
技术研发人员：D·J·F·沃克，S·那加拉祖，M·科普克，A·P·穆勒，
申请(专利权)人：朗泽科技新西兰有限公司，
类型：发明
国别省市：新西兰;NZ
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