本发明专利技术公开了一种两步微生物转化法制备R‑扁桃酸的方法，所述方法为：以苯甲酰甲酸乙酯为底物，以酿酒酵母经发酵培养获得的菌体为催化剂，以pH值6‑8的缓冲液为反应介质，在20‑45℃、100‑200rpm条件下进行转化反应，获得R‑扁桃酸乙酯；以R‑扁桃酸乙酯为底物，以蜡样芽孢杆菌经发酵培养获得的菌体为催化剂，以有机溶剂为助溶剂，以pH值7‑9的缓冲液为反应介质，在20‑40℃、100‑200rpm条件下进行反应，获得R‑扁桃酸。本发明专利技术方法成本低廉，环境友好，反应条件温和；易于大规模工业化生产；操作简便，摩尔转化率较高；可将产率提高到99.8％，ee值提高到100％。
【技术实现步骤摘要】
(一)
本专利技术涉及一种R-扁桃酸的制备，特别涉及一种以苯甲酰甲酸乙酯为原料经两步微生物转化法分别实现还原、水解过程来合成R-扁桃酸的新工艺，尤其是以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No.3361转化苯甲酰甲酸乙酯制备R-扁桃酸乙酯和以蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)CGMCC No.12336水解R-扁桃酸乙酯生成R-扁桃酸。(二)
技术介绍
扁桃酸(Mandelic acid，MA)，学名α-羟基苯乙酸，又名苦杏仁酸、苯羟乙酸。手性扁桃酸是重要的氨基酸合成前体和药物中间体。R-扁桃酸是合成青霉素、头孢拉定等抗生素的重要中间体，还可以用于合成抗肿瘤药物Goniothalam us styryllactones、治疗水肿和风湿疾病的药物(+)-Crassalactone A。目前市场上对手性扁桃酸的需求远远大于对其外消旋体的需求。因此，手性扁桃酸成为热点的精细化工中间体。扁桃酸化学式为C8H8O3，CAS号：90-64-2，分子量152.15，熔点118-121℃，易溶于水、乙醇，采用微生物不对称还原苯甲酰甲酸乙酯制备R-扁桃酸乙酯，R-扁桃酸乙酯经另一种微生物水解后生成R-扁桃酸。该途径是制备R-扁桃酸的绿色合成路线，是合成R-扁桃酸的有效方法。光学纯扁桃酸的生产方法主要有物理化学方法、化学法和生物催化法。物理化学方法主要包括毛细管电泳法和色谱分离法。色谱法中主要有高效液相色谱法(HPLC)和气相色谱法(GC)。色谱法不能够实现手性扁桃酸的工业化大规模生产。化学法生产手性扁桃酸主要分为非对映体盐结晶拆分法、不对称合成法和电化学法等。采用化学法生产具有反应条件苛刻，环境污染大的缺点。生物方法生产光学纯扁桃酸主要有氧化还原法和水解法等。本专利技术采用酿酒酵母CGMCC No.3361不对称还原苯甲酰甲酸乙酯制备R-扁桃酸乙酯，再进一步采用蜡样芽孢杆菌CGMCC No.12336水解R-扁桃酸乙酯的两步微生物转化法制备手性扁桃酸，该过程具有反应条件温和、产物对映体过剩值高和环境友好等优点。采用微生物转化法经苯甲酰甲酸乙酯还原、水解两步工艺制备R-扁桃酸。现有技术主要采用外消旋扁桃酸乙酯拆分方法制备R-扁桃酸，转化率理论上最高只有50％，而本方法的转化率理论上可以达到100％，本专利技术实施例中可以达到97.2％，R-扁桃酸的对应体过剩值达到100％。本专利技术的工艺过程未见专利报道，也未见到文献报道，是一种全新的、环保、节能、高效的R-扁桃酸的合成工艺。(三)
技术实现思路
本专利技术目的解决了现有技术中原料利用率低，污染大，成本高等问题。提供一种两步微生物转化法制备R-扁桃酸的方法，采用两种催化效率高的微生物酿酒酵母CGMCC No.3361和蜡样芽孢杆菌CGMCC No.12336，以苯甲酰甲酸乙酯为底物，经过不对称还原和水解两步反应最终合成R-扁桃酸的方法。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种两步微生物转化法制备R-扁桃酸的方法，所述方法为：步骤(1)：以苯甲酰甲酸乙酯为底物，以酿酒酵母经发酵培养获得的菌体为催化剂，以pH值6-8的缓冲液为反应介质，在20-45℃、100-200rpm条件下进行转化反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得R-扁桃酸乙酯；步骤(2)：以R-扁桃酸乙酯为底物，以蜡样芽孢杆菌经发酵培养获得的菌体为催化剂，以有机溶剂为助溶剂，以pH值7-9的缓冲液为反应介质，在20-40℃、100-200rpm条件下进行反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得R-扁桃酸。进一步，步骤(1)所述酿酒酵母为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No.3361，已在专利申请CN101709271A中公开，菌落特征：在琼脂培养基上呈现出乳白色、有光泽、平坦、边缘整齐、湿润、表面光滑，质地均匀的菌落形态。进一步，步骤(1)所述底物用量以反应介质体积计为0.02-0.17mol/L，所述催化剂用量以湿菌体干重计，所述湿菌体用量以反应介质体积计为0.04-0.16g/ml。进一步，步骤(1)所述催化剂按如下方法制备：(1)斜面培养：将酿酒酵母(优选Saccharomyces cerevisiae CGMCC No.3361)接种至斜面培养基，26-35℃培养2-3天；所述斜面培养基组成：麦芽汁8-12g/L，酵母粉2-4g/L，蛋白胨4-6g/L，葡萄糖8-12g/L，琼脂18-22g/L，溶剂为水，pH为自然；优选所述的斜面培养基组成：麦芽汁10g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，pH为自然；(2)种子培养：用接种针从斜面培养基中取一接种环菌体接种在含有100ml种子培养基的250ml三角瓶中，于30℃、180rpm的条件下培养24h，获得种子液；所述种子培养基组成：葡萄糖28-32g/L，酵母粉2-4g/L，硫酸铵4-6g/L，KH2PO4 0.5-1.5g/L，K2HPO4·3H2O 0.5-1.5g/L，MgSO4 0.2-0.3g/L，溶剂为水，pH为自然；优选种子培养基组成：葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L，硫酸铵5g/L，KH2PO4 1g/L，K2HPO4·3H2O 1g/L，MgSO4 0.25g/L，溶剂为水，pH为自然；(3)发酵培养：将种子液以体积浓度10％的接种量接种于含有500ml发酵培养基的1000ml三角瓶中，于30℃、180rpm的条件下培养24h，获得发酵液，发酵液离心，得湿菌体；发酵培养基组成同种子培养基。进一步，步骤(1)所述反应液分离纯化的方法为：反应结束后，将反应液加入3倍体积乙酸乙酯连续萃取3次，取乙酸乙酯旋转蒸发除去大部分有机溶剂后，加入无水硫酸钠脱水，抽滤，滤液旋转蒸发除去剩余的有机溶剂，即得所述R-扁桃酸乙酯，产率达99.8％，对映体过剩值达100％。进一步，步骤(2)所述蜡样芽孢杆菌为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)Zjut ml 10，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.12336，保藏日期2016年4月11日，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。菌落特征：在琼脂培养基上呈现白色(似蜡烛样颜色)、稍有光泽、平坦、近似圆形、质地软的菌落形态。进一步，步骤(2)所述底物用量以反应介质体积计为0.015-0.09mol/L，所述催化剂用量以湿菌体干重计，所述湿菌体用量以反应介质体积计为0.01-0.1g/ml，所述助溶剂体积用量以反应介质体积计为5％。进一步，步骤(2)所述助溶剂为下列之一：二甲基亚砜、甲醇、乙醇、异丙醇、乙酸乙酯和正己烷。进一步，步骤(2)所述催化剂按如下方法制备：(1)斜面培养：将蜡样芽孢杆菌(优选蜡样芽孢杆菌为蜡样芽孢杆菌Zjut ml 10)接种至斜面培养基，26-35℃培养1-2天；所述的斜面培养基组成：葡萄糖8-10g/L，酵母膏4-6g/L，蛋白胨2-3g/L，NaCl 1-3g/L，KH2PO4 1-3g/L，K2HPO4 1-3g/L，MgSO4 0.4-0本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种两步微生物转化法制备R‑扁桃酸的方法，其特征在于所述方法为：(1)以苯甲酰甲酸乙酯为底物，以酿酒酵母经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以pH值6‑8的缓冲液为反应介质，在20‑45℃、100‑200rpm条件下进行转化反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得R‑扁桃酸乙酯；(2)以R‑扁桃酸乙酯为底物，以蜡样芽孢杆菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以有机溶剂为助溶剂，以pH值7‑9的缓冲液为反应介质，在20‑40℃、100‑200rpm条件下进行反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得R‑扁桃酸。
【技术特征摘要】
1.一种两步微生物转化法制备R-扁桃酸的方法，其特征在于所述方法为：(1)以苯甲酰甲酸乙酯为底物，以酿酒酵母经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以pH值6-8的缓冲液为反应介质，在20-45℃、100-200rpm条件下进行转化反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得R-扁桃酸乙酯；(2)以R-扁桃酸乙酯为底物，以蜡样芽孢杆菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以有机溶剂为助溶剂，以pH值7-9的缓冲液为反应介质，在20-40℃、100-200rpm条件下进行反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得R-扁桃酸。2.如权利要求1所述两步微生物转化法制备R-扁桃酸的方法，其特征在于步骤(1)所述酿酒酵母为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No.3361。3.如权利要求1所述两步微生物转化法制备R-扁桃酸的方法，其特征在于步骤(1)所述底物用量以反应介质体积计为0.02-0.17mol/L，所述催化剂用量以湿菌体干重计，所述湿菌体用量以反应介质体积计为0.04-0.16g/ml。4.如权利要求1所述两步微生物转化法制备R-扁桃酸的方法，其特征在于步骤(1)所述催化剂按如下方法制备：(1)斜面培养：将酿酒酵母接种至斜面培养基，26-35℃培养2-3天；所述的斜面培养基组成：麦芽汁8-12g/L，酵母粉2-4g/L，蛋白胨4-6g/L，葡萄糖8-12g/L，琼脂18-22g/L，溶剂为水，pH为自然；(2)种子培养：用接种针从斜面培养基中取一接种环菌体接种在含有100ml种子培养基的250ml三角瓶中，于30℃、180rpm的条件下培养24h获得种子液；种子培养基组成：葡萄糖28-32g/L，酵母粉2-4g/L，硫酸铵4-6g/L，KH2PO4 0.5-1.5g/L，K2HPO4·3H2O 0.5-1.5g/L，MgSO4 0.2-0.3g/L，溶剂为水，pH为自然；(3)发酵培养：将种子液以体积浓度10％的接种量接种于含有500ml发酵培养基的1000ml三角瓶中，于30℃、180rpm的条件下培养24h，获得发酵液，发酵液离心，得湿菌体；发酵培养基组成同种子培养基。5.如权利要求1所述两步微生物转化法制备R-扁桃酸的方法，其特征在于步骤(1)所述反应液分离纯化的方法为：反应结束后，将反应液加入乙酸乙酯连续萃取，取乙酸乙酯层旋转蒸发除去大部分有机溶剂，加入无水硫酸钠脱水，抽滤，滤液旋转蒸发...
【专利技术属性】
技术研发人员：欧志敏，马兰，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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