用于生物合成化合物的方法，试剂和细胞技术

本文件描述了使用脂肪酸O‑甲基转移酶，醇O‑乙酰转移酶和单加氧酶中的一种或多种产生6‑羟基己酸甲酯和己酸己酯的生物化学途径，以及表达一种或多种此类酶的重组宿主。可以将6‑羟基己酸甲酯和己酸己酯酶促转化为己二酸，己二酸半醛，6‑氨基己酸，6‑羟基己酸，六亚甲基二胺和1,6‑己二醇。

Methods, reagents, and cells for biosynthesis of compounds

This document describes the use of O fatty acid methyl transferase enzyme, and one or more enzymes in single 6 hydroxy methyl hexanoate and Hexyl Hexanoate the biochemical pathway of transfer acetyl alcohol O, as well as the expression of one or more of these enzymes in recombinant host. Can be 6 hydroxy methyl hexanoate Hexyl Hexanoate and enzymatic conversion of adipic acid, adipaldehyde, 6 aminocaproic acid, 6 3-hydroxyhexanoate six, two methylene amine and 1,6 hexandiol.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于生物合成化合物的方法，试剂和细胞对相关申请的交叉引用本申请要求于2014年6月16日提交的美国临时申请序列号62/012,659，于2014年6月16日提交的62/012,666和于2014年6月16日提交的62/012,604的权益，其全部内容通过引用并入本文。
本专利技术涉及使用一种或多种分离的酶(如脂肪酸O-甲基转移酶，醇O-乙酰转移酶和单加氧酶)生物合成6-羟基己酸甲酯和己酸己酯的方法，以及表达一种或多种此类酶的重组宿主细胞。本专利技术还涉及使用一种或多种酶，如酯酶，单加氧酶和脱甲基酶将6-羟基己酸甲酯和己酸己酯酶促转化为6-羟基己酸和1,6-己二醇的方法。此外，本专利技术涉及将6-羟基己酸和/或1,6-己二醇酶促转化为己二酸，6-氨基己酸，六亚甲基二胺或1,6-己二醇(以下称为“C6构件块”)和产生此类C6构件块的重组宿主。专利技术背景尼龙是聚酰胺，其一般通过二胺与二羧酸的缩合聚合(condensationpolymerization)合成。类似地，可以通过内酰胺的缩合聚合生成尼龙。一种普遍存在的尼龙是尼龙6,6，其通过六亚甲基二胺(HMD)和己二酸的缩合聚合生成。本文档来自技高网...

【技术保护点】
在重组宿主中产生末端羟基(C

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.06.16 US 62/012,659;2014.06.16 US 62/012,666;1.在重组宿主中产生末端羟基(C3-8羟基烷基)-C(＝O)OCH3酯的方法，所述方法包括：a)将C4-9羧酸酶促转化成(C3-8烷基)-C(＝O)OCH3酯；并且b)将(C3-8烷基)-C(＝O)OCH3酯酶促转化成末端羟基(C3-8羟基烷基)-C(＝O)OCH3酯。2.权利要求1的方法，其中使用具有脂肪酸O-甲基转移酶活性的多肽将C4-9羧酸酶促转化成(C3-8烷基)-C(＝O)OCH3酯。3.权利要求2的方法，其中所述具有脂肪酸O-甲基转移酶活性的多肽与SEQIDNO:22，SEQIDNO:23或SEQIDNO:24所示的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。4.权利要求1-3中任一项的方法，其中使用具有单加氧酶活性的多肽将(C3-8烷基)-C(＝O)OCH3酯酶促转化成末端羟基(C3-8羟基烷基)-C(＝O)OCH3酯。5.权利要求4的方法，其中所述具有单加氧酶活性的多肽归类在EC1.14.14.-或EC1.14.15.-下。6.权利要求4的方法，其中所述具有单加氧酶活性的多肽与SEQIDNO:13-15，SEQIDNO:27和/或SEQIDNO:28所示的氨基酸序列具有至少70％序列同一性。7.权利要求1-6中任一项的方法，其中从C4-9烷酰基(alkanoyl)-CoA酶促产生所述C4-9羧酸。8.权利要求7的方法，其中具有硫酯酶活性的多肽从C4-9烷酰基-CoA酶促产生所述C4-9羧酸。9.权利要求8的方法，其中所述具有硫酯酶活性的多肽与SEQIDNO:1，SEQIDNO:32或SEQIDNO:33所示的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。10.权利要求7的方法，其中具有丁醛脱氢酶活性的多肽和具有醛脱氢酶活性的多肽从C4-9烷酰基-CoA酶促产生所述C4-9羧酸。11.权利要求1-10中任一项的方法，所述方法还包括将末端羟基(C3-8羟基烷基)-C(＝O)OCH3酯酶促转化成末端羟基C4-9羟基链烷酸(hydroxyalkanoate)。12.权利要求11的方法，其中具有脱甲基酶活性的多肽或具有酯酶活性的多肽将末端羟基(C3-8羟基烷基)-C(＝O)OCH3酯酶促转化成末端羟基C4-9羟基链烷酸。13.权利要求1-12中任一项的方法，其中C4-9羧酸是己酸，并且酶促转化成己酸甲酯；并且将所述己酸甲酯酶促转化为6-羟基己酸甲酯。14.权利要求7-13中任一项的方法，其中所述C4-9烷酰基-CoA是己酰基-CoA，并且从己酰基-CoA酶促产生己酸。15.在重组宿主中产生一种或多种末端羟基取代的(C4-9烷基)-OC(＝O)-(C3-8烷基)酯的方法，所述方法包括：a)在所述宿主中将C4-9烷酰基-CoA酶促转化成(C4-9烷基)-OC(＝O)-(C3-8烷基)酯；并且b)将(C4-9烷基)-OC(＝O)-(C3-8烷基)酯酶促转化成(C4-9烷基)-OC(＝O)-(C3-8羟基烷基)酯，(C4-9羟基烷基)-OC(＝O)-(C3-8羟基烷基)酯，或(C4-9羟基烷基)-OC(＝O)-(C3-8烷基)酯中的任一种。16.权利要求15的方法，其中使用具有醇O-乙酰转移酶活性的多肽将C4-9烷酰基-CoA酶促转化成(C4-9烷基)-OC(＝O)-(C3-8烷基)酯。17.权利要求16的方法，其中所述具有醇O-乙酰转移酶活性的多肽与SEQIDNO:25所示的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。18.权利要求15-17中任一项的方法，其中使用具有单加氧酶活性的多肽将(C4-9烷基)-OC(＝O)-(C3-8烷基)酯酶促转化为(C4-9烷基)-OC(＝O)-(C3-8羟基烷基)酯，(C4-9羟基烷基)-OC(＝O)-(C3-8羟基烷基)酯或(C4-9羟基烷基)-OC(＝O)-(C3-8烷基)酯中的任一种。19.权利要求18的方法，其中所述具有单加氧酶活性的多肽归类在EC1.14.14.-或EC1.14.15.-下。20.权利要求18或权利要求19的方法，其中所述具有单加氧酶活性的多肽与SEQIDNO:13-15，SEQIDNO:27和/或SEQIDNO:28所示的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。21.权利要求15-20中任一项所述的方法，所述方法还包括将(C4-9羟基烷基)-OC(＝O)-(C3-8羟基烷基)酯或(C4-9羟基烷基)-OC(＝O)-(C3-8烷基)酯酶促转化为末端羟基C4-9羟基链烷酸。22.权利要求21的方法，其中具有酯酶活性的多肽将(C4-9羟基烷基)-OC(＝O)-(C3-8羟基烷基)酯或(C4-9羟基烷基)-OC(＝O)-(C3-8烷基)酯酶促转化为C4-9羟基链烷酸。23.权利要求15-22中任一项的方法，其中所述C4-9烷酰基-CoA是己酰基-CoA，并且被酶促转化成己酸己酯；并且使用具有单加氧酶活性的多肽将所述己酸己酯酶促转化为6-羟基己酸己酯，6-羟基己酸6-羟基己酯或己酸6-羟基己酯中的任一种。24.权利要求23中任一项的方法，所述方法还包括将6-羟基己酸6-羟基己酯或6-羟基己酸己酯酶促转化为6-羟基己酸。25.权利要求24的方法，其中具有酯酶活性的多肽将6-羟基己酸6-羟基己酯或6-羟基己酸己酯酶促转化成6-羟基己酸。26.根据权利要求23-25中任一项的方法，所述方法还包括将6-羟基己酸6-羟基己酯或己酸6-羟基己酯酶促转化为1,6-己二醇。27.权利要求26的方法，其中具有酯酶活性的多肽将6-羟基己酸6-羟基己酯或己酸6-羟基己酯酶促转化为1,6-己二醇。28.权利要求26或权利要求27的方法，所述方法还包括将1,6-己二醇酶促转化为6-羟基己酸。29.权利要求28的方法，其中具有醇脱氢酶活性的多肽和具有醛脱氢酶活性的多肽将1,6-己二醇酶促转化为6-羟基己酸。30.权利要求13-14中任一项的方法，所述方法还包括将6-羟基己酸甲酯酶促转化为6-羟基己酸。31.权利要求30的方法，其中具有脱甲基酶或酯酶活性的多肽将6-羟基己酸甲酯酶促转化为6-羟基己酸。32.权利要求24-31中任一项的方法，所述方法还包括将6-羟基己酸酶促转化为选自下组的产物：己二酸，己二酸半醛，6-氨基己酸，六亚甲基二胺和1,6-己二醇。33.权利要求32的方法，其中所述方法包括使用具有醇脱氢酶活性的多肽，具有6-羟基己酸脱氢酶活性的多肽，具有5-羟基戊酸脱氢酶活性的多肽，具有4-羟基丁酸脱氢酶活性的多肽或具有单加氧酶活性的多肽将6-羟基己酸酶促转化为己二酸半醛。34.权利要求33的方法，所述方法还包括使用具有5-氧代戊酸脱氢酶活性的多肽，具有6-氧代己酸脱氢酶活性的多肽，具有7-氧代庚酸脱氢酶活性的多肽，具有醛脱氢酶活性的多肽或具有单加氧酶活性的多肽将己二酸半醛酶促转化为己二酸。35.权利要求33的方法，所述方法还包括将己二酸半醛酶促转化为6-氨基己酸。36.权利要求35的方法，其中具有ω-转氨酶活性的多肽将己二酸半醛酶促转化为6-氨基己酸。37.权利要求35或权利要求36的方法，所述方法还包括将6-氨基己酸酶促转化为六亚甲基二胺。38.权利要求33的方法，所述方法还包括将己二酸半醛酶促转化为六亚甲基二胺。39.权利要求37或权利要求38的方法，其中使用具有羧酸还原酶活性的多肽和/或具有ω-转氨酶活性的多肽，和任选地具有N-乙酰转移酶活性的多肽，具有乙酰腐胺脱乙酰酶活性的多肽和具有醇脱氢酶活性的多肽中的一种或多种将己二酸半醛或6-氨基己酸酶促转化为六亚甲基二胺。40.权利要求39的方法，其中通过sfp的基因产物增强所述具有羧酸还原酶的多肽。41.权利要求39或权利要求40的方法，其中所述方法包括使用具有羧酸还原酶活性的多肽和具有醇脱氢酶活性的多肽将6-羟基己酸酶促转化为1,6-己二醇。42.权利要求41的方法，所述方法还包括将1,6-己二醇酶促转化为六亚甲基二胺。43.权利要求42的方法，其中具有醇脱氢酶活性的多肽和具有ω-转氨酶活性的多肽将1,6-己二醇酶促转化为六亚甲基二胺。44.权利要求32的方法，其中具有羧酸还原酶活性的多肽，具有ω-转氨酶活性的多肽和具有醇脱氢酶活性的多肽将6-羟基己酸酶促转化为六亚甲基二胺。45.权利要求36、39-40和43-45中任一项的方法，其中所述具有ω-转氨酶活性的多肽与SEQIDNO.7-12所示的任一氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。46.权利要求14和23-45中任一项的方法，其中通过CoA依赖性碳链延长的两个循环从乙酰基-CoA产生己酰基-CoA。47.权利要求46的方法，其中所述CoA依赖性碳链延长的两个循环的每个包括使用(i)具有β-酮硫解酶活性的多肽或具有乙酰基-CoA羧化酶活性的多肽和具有β-酮脂酰基-[acp]合酶活性的多肽，(ii)具有3-羟基酰基-CoA脱氢酶活性的多肽或具有3-氧代酰基-CoA还原酶活性的多肽，(iv)具有烯酰基-CoA水合酶活性的多肽，和(v)具有反式-2-烯酰基-CoA还原酶活性的多肽以从乙酰基-CoA形成己酰基-CoA。48.酶促产生6-羟基己酸的方法，所述方法包括：a)使用具有脂肪酸O-甲基转移酶活性的多肽将己酸酶促转化为己酸甲酯；b)使用具有单加氧酶活性的多肽将己酸甲酯酶促转化为6-羟基己酸甲酯；并且c)使用具有脱甲基酶活性的多肽或具有酯酶活性的多肽将6-羟基己酸甲酯酶促转化为6-羟基己酸。49.酶促产生6-羟基己酸的方法，所述方法包括：a)使用具有醇O-乙酰转移酶活性的多肽将己酰基-CoA酶促转化成己酸己酯；b)使用具有单加氧酶活性的多肽将己酸己酯酶促转化成6-羟基己酸己酯，己酸6-羟基己酯或6-羟基己酸6-羟基己酯；并且c)使用具有酯酶活性的多肽将6-羟基己酸己酯，己酸6-羟基己酯或6-羟基己酸6-羟基己酯酶促转化为6-羟基己酸。50.权利要求1-49中任一项的方法，其中所述重组宿主经受在需氧，厌氧，或微需氧培养条件下的培养策略。51.权利要求50的方法，其中所述重组宿主在营养物限制，如磷酸盐，氮和氧限制的条件下培养。52.权利要求50或权利要求51的方法，其中使用陶瓷膜保留所述重组宿主以在发酵期间维持高细胞密度。53.权利要求50-52中任一项的方法，其中供给所述重组宿主的主要碳源源自生物原料。54.权利要求53的方法，其中所述生物原料是单糖，二糖，木质纤维素，半纤维素，纤维素，木质素，乙酰丙酸，甲酸，甘油三酯，甘油，脂肪酸，农业废物，浓缩酒糟(condenseddistillers’solubles)，或城市废物。55.权利要求49-52中任一项的方法，其中供给所述重组宿主的主要碳源源自非生物原料。56.权利要求55的方法，其中所述非生物原料是或源自天然气、合成气、CO2/H2、甲醇、乙醇、苯甲酸盐、来自环己烷氧化过程的非挥发性残留物(NVR)碱洗液(causticwash)废物流、或对苯二甲酸/异酞酸混合物废物流。57.权利要求50-56中任一项的方法，其中所述重组宿主是原核生物。58.权利要求57的方法，其中所述原核生物来自选自下组的属：埃希氏菌属(Escherichia)；梭菌属(Clostridia)；棒状杆菌属(Corynebacteria)；贪铜菌属(Cupriavidus)；假单胞菌属(Pseudomonas)；代尔夫特菌属(Delftia)；芽孢杆菌属(Bacilluss)；乳杆菌属(Lactobacillus)；乳球菌属(Lactococcus)；和红球菌属(Rh...

【专利技术属性】
技术研发人员：AL博特斯，AVE康拉迪，R哈杜奇，
申请(专利权)人：英威达技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH