用于生物制备极长碳链化合物的方法技术

本公开提供用于从利用C1底物如甲烷或天然气作为饲料的重组C1代谢微生物生物制备极长碳链化合物(长于C24)如脂肪酰‑辅酶A、脂肪醛、脂肪醇、脂肪酯蜡、烷类和酮类的组合物和方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】背景
本公开内容提供用于生物制备极长碳链化合物的组合物和方法，并且，更具体地，使用重组C1代谢微生物由C1底物(如甲烷或天然气)生产极长链脂肪醇、极长链醛、极长链烷、极长链酮或极长链脂肪酯蜡。背景描述极长链脂肪酸是具有多于24个碳的脂肪族尾的脂肪酸。它们包括与末端碳连接的非极性(亲脂的)、饱和或不饱和、烃链和极性(亲水的)羧基。极长链脂肪酸可以被包含在蜡内或用作在蜡中发现的其他脂族烃的前体，所述脂族烃包括烷、伯醇和仲醇、酮、醛和酰基脂。极长链脂肪酸和其衍生物是高价值的化学品，其可用于生产膳食补充物、食品、药物制剂、润滑剂、去垢剂、表面活性剂、化妆品、尼龙、涂层、粘合剂和生物燃料。从天然来源和化学合成提供极长脂肪酸对于商业需要是不足够的。通过天然来源或化学合成获得极长脂肪酸需要苛刻的生产环境、昂贵的起始材料、使用有限的环境资源或产生有害副产物。已经对极长链脂肪酸的生物工程生产进行了越来越多的尝试。很多工作集中在转基因植物的种子油中生产。重组微生物，如大肠杆菌和各种酵母也已经用于将生物质来源的饲料转化为极长链脂肪酸。然而，即使使用相对便宜的纤维质生物质作为饲料，碳水化合物饲料超过一半的质量包含氧，其对转化效率是显著的限制。极长链脂肪酸和它们的衍生物(如极长链脂肪醇、极长链脂肪醛、极长链烷、极长链蜡酯和极长链酮)相比碳水化合物饲料具有显著较低的氧含量，其限制了理论产率，因为大部分碳水化合物氧必需作为废物排除。因此，从碳水化合物饲料生产极长链脂肪酸和它们的衍生物的成本过于昂贵。鉴于与生产极长链脂肪酸和相关化合物的基于碳水化合物的发酵方法相关的限制，在本领域中需要替代的、成本有效的和环境友好的方法来生产极长链脂肪酸。本公开内容满足这些需求，并且还提供其他相关益处。概述在某些方面，本公开内容涉及制备极长碳链化合物的方法，所述方法是通过(A)用C1底物饲料培养非天然C1代谢非光合微生物，其中所述C1代谢非光合微生物包含一种或多种编码以下酶的重组核酸分子：β-酮酰-辅酶A合酶(KCS)；β-酮酰-辅酶A还原酶(KCR)；β-羟酰-辅酶A脱水酶(HCD)；烯酰-辅酶A还原酶(ECR)；其中所述C1代谢非光合微生物将C1底物转化为极长碳链化合物，所述极长碳链化合物包括极长链脂肪酰-辅酶A、极长链脂肪醛、极长链脂肪醇、极长链脂肪酯蜡、极长链烷、极长链酮或其组合；和(B)回收所述极长碳链化合物。在相关方面，本公开内容提供非天然嗜甲烷菌(methanotroph)，其包含一种或多种编码以下酶的重组核酸分子：β-酮酰-辅酶A合酶(KCS)；β-酮酰-辅酶A还原酶(KCR)；β-羟酰-辅酶A脱水酶(HCD)；烯酰-辅酶A还原酶(ECR)，其中所述嗜甲烷菌能够将C1底物转化为极长碳链化合物，所述极长碳链化合物包括极长链脂肪酰-辅酶A、极长链脂肪醛、极长链脂肪醇、极长链脂肪酯蜡、极长链烷、极长链酮或其组合。在某些实施方案中，提供非天然嗜甲烷菌，其含有编码脂肪酰-辅酶A还原酶的重组核酸分子，其中所述嗜甲烷菌能够将C1底物转化为极长链脂肪醛。在某些实施方案中，提供非天然嗜甲烷菌，其含有编码异源脂肪醇形成酰基-辅酶A还原酶的重组核酸分子，或编码异源脂肪酰-辅酶A还原酶的重组核酸分子，和编码异源醛还原酶的重组核酸分子，其中所述嗜甲烷菌能够将C1底物转化为极长链脂肪醇。在进一步实施方案中，提供的是非天然嗜甲烷菌，其含有编码异源脂肪醇形成酰基-辅酶A还原酶的重组核酸分子和编码异源酯合酶的重组核酸分子，其中所述嗜甲烷菌能够将C1底物转化为极长链脂肪酯蜡。在某些实施方案中，提供非天然嗜甲烷菌，其含有编码异源脂肪酰-辅酶A还原酶的重组核酸分子，和编码异源醛脱羰基酶的重组核酸分子，其中所述嗜甲烷菌能够将C1底物转化为极长链烷。在进一步实施方案中，提供非天然嗜甲烷菌，其含有编码异源脂肪酰-辅酶A还原酶的重组核酸分子，编码异源醛脱羰基酶的重组核酸分子，和编码异源烷羟化酶的重组核酸分子，其中所述嗜甲烷菌能够将C1底物转化为极长链酮。在另一方面，本公开内容提供C1代谢微生物生物质，其包含极长碳链化合物组合物，其中所述含有极长碳链化合物的生物质或源自其的极长碳链化合物组合物具有约-35‰至约-50‰，-45‰至约-35‰，或约-50‰至约-40‰，或约-45‰至约-65‰，或约-60‰至约-70‰，或约-30‰至约-70‰的δ13C。在某些实施方案中，极长碳链化合物组合物包含极长链脂肪酰-辅酶A、极长链脂肪醛、极长链脂肪醇、极长链脂肪酯蜡、极长链烷、极长链酮或其任意组合。在更进一步实施方案中，极长碳链化合物组合物包含C25-C50极长链脂肪酰-辅酶A，C25-C50极长链脂肪醛，C25-C50极长链脂肪醇，C25-C50极长链脂肪酯蜡，C25-C50极长链烷，或C25-C50极长链酮。在更进一步实施方案中，极长碳链化合物组合物包含大部分(多于50％w/w)的碳链长度为C25-C50的极长碳链化合物或大部分的碳链长度大于C24的极长碳链化合物，或含有极长碳链化合物的组合物，其中总极长碳链化合物的至少包含70％的C25-C50极长碳链化合物。附图简述图1显示用于极长链酰基辅酶A生产的脂肪酸延伸途径的纵览。图2显示极长链脂肪伯醇生产的纵览。图3显示极长链脂肪酯蜡生产的纵览。图4显示极长链烷生产和极长链酮生产的纵览。图5显示用于脂肪醇生产的酰基-辅酶A依赖性FAR途径的纵览。图6显示用于脂肪醇生产的酰基-辅酶A不依赖性FAR途径的纵览。图7显示用于脂肪醇生产的酰基-辅酶A不依赖性CAR途径的纵览。图8显示ω-羟基脂肪酸生产途径的纵览。图9显示二羧酸生产途径的纵览。图10显示脂肪酯生产的酰基-辅酶A依赖性FAR途径的纵览。图11显示各种碳源的δ13C分布的示意图。详述本公开内容提供产生极长碳链化合物的组合物和方法。例如，用C1底物饲料(例如，甲烷)培养重组C1代谢微生物以产生大于C24的脂肪酰-辅酶A、脂肪醛、脂肪醇、脂肪酯蜡、烷、酮或其任意组合。该新方法允许使用嗜甲基细菌或嗜甲烷细菌作为新的宿主系统以生产极长链脂肪酸衍生物以用于生产例如膳食补充物、食品、药物制剂、润滑剂、去垢剂、表面活性剂、化妆品、尼龙、涂层、粘合剂或生物燃料。根据背景，来自包括天然气在内的多种来源的甲烷代表充足的国内来源。如上述的，基于碳水化合物的饲料含有超过其一半质量的氧，这对转化效率是显著的限制，因为极长链脂肪酸的氧含量显著低于这些饲料。解决目前的系统的限制的方案是利用甲烷或天然气作为用于转化的饲料。来自天然气的甲烷便宜且充足，并且重要的是不含有氧，这允许理论转化效率的显著改善。此外，与碳水化合物饲料相比，C1碳源便宜并且充足，这进一步有助于极长链脂肪酸生产的经济性。极长链脂肪酸生产是很多不同生物中的重要通路，因为需要其用于多种生理学功能，如皮肤屏障形成、视网膜形成、炎症的解决、髓鞘的维持、精子发育和成熟、肝稳态、核孔中的高膜曲度、GPI脂锚的合成和植物种子中三酰甘油的储存。极长链脂肪酸还是植物角质层蜡和膜鞘脂的成分。脂肪酸以酰基-辅酶A的形式延长，其中脂肪酸通过硫脂键连接于辅酶A。在本公开内容中，应用代谢工程技术以提供脂肪酸延伸途径(例如，β-酮酰-辅酶A合酶、β-酮酰-辅本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于制备极长碳链化合物的方法，所述方法包括：(a)用C1底物饲料培养非天然C1代谢非光合微生物，其中所述C1代谢非光合微生物包含编码以下酶的一种或多种重组核酸分子：(i)β‑酮酰‑辅酶A合酶(KCS)；(ii)β‑酮酰‑辅酶A还原酶(KCR)；(iii)β‑羟酰‑辅酶A脱水酶(HCD)；和(iv)烯酰‑辅酶A还原酶(ECR)；其中所述C1代谢非光合微生物将所述C1底物转化为极长碳链化合物；和(b)回收所述极长碳链化合物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.05.15 US 61/994,0421.用于制备极长碳链化合物的方法，所述方法包括：(a)用C1底物饲料培养非天然C1代谢非光合微生物，其中所述C1代谢非光合微生物包含编码以下酶的一种或多种重组核酸分子：(i)β-酮酰-辅酶A合酶(KCS)；(ii)β-酮酰-辅酶A还原酶(KCR)；(iii)β-羟酰-辅酶A脱水酶(HCD)；和(iv)烯酰-辅酶A还原酶(ECR)；其中所述C1代谢非光合微生物将所述C1底物转化为极长碳链化合物；和(b)回收所述极长碳链化合物。2.权利要求1所述的方法，其中所述极长碳链化合物是极长链脂肪酰-辅酶A。3.权利要求1所述的方法，其中所述C1代谢非光合微生物还包含编码能够形成极长链脂肪醇的脂肪醇形成酰基-辅酶A还原酶(FAR)的核酸分子，并且其中所述极长碳链化合物是极长链脂肪伯醇。4.权利要求1所述的方法，其中所述C1代谢非光合微生物还包含编码能够形成极长链脂肪醛的脂肪酰-辅酶A还原酶和能够形成极长链脂肪醇的醛还原酶的核酸分子，并且其中所述极长碳链化合物是极长链脂肪伯醇。5.权利要求1所述的方法，其中所述C1代谢非光合微生物还包含编码能够形成极长链脂肪醛的脂肪酰-辅酶A还原酶的核酸分子并且其中所述极长碳链化合物是极长链脂肪醛。6.权利要求1所述的方法，其中所述C1代谢非光合微生物包含编码能够形成极长链脂肪醛的脂肪酰-辅酶A还原酶和能够形成极长链烷的醛脱羰基酶的核酸分子，并且其中所述极长碳链化合物是极长链烷。7.权利要求1所述的方法，其中所述C1代谢非光合微生物包含编码能够形成极长链脂肪醛的脂肪酰-辅酶A还原酶，能够形成极长链烷的醛脱羰基酶，和能够形成极长链脂肪仲醇的烷羟化酶，和能够形成极长链酮的醇脱氢酶的核酸分子，其中所述极长碳链化合物是极长链酮。8.权利要求1所述的方法，其中所述C1代谢非光合微生物包含编码能够形成极长链脂肪醇的脂肪醇形成酰基-辅酶A还原酶和能够形成极长链脂肪酯蜡的酯合酶的核酸分子，并且其中所述极长碳链化合物是极长链脂肪酯蜡。9.权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述KCS是CER6、Elo1、Fen1/Elo2、Sur4/Elo3、KCS1或FDH。10.权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述KCR是Ybr159w、AYR1、GL8A、GL8B或At1g67730。11.权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述HCD是PHS1、PAS2或PAS2-1。12.权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述ECR是CER10或TSC13。13.权利要求3所述的方法，其中所述脂肪醇形成酰基-辅酶A还原酶是FAR、CER4或Maqu_2220。14.权利要求5或6所述的方法，其中所述脂肪酰-辅酶A还原酶是ACR1或CER3。15.权利要求4所述的方法，其中所述醛还原酶是醇脱氢酶，其中所述醇脱氢酶是YqhD。16.权利要求8所述的方法，其中所述酯合酶是WSD1。17.权利要求6所述的方法，其中所述醛脱羰基酶是CER1或CER22。18.权利要求7所述的方法，其中所述烷羟化酶是MAH1。19.权利要求7所述的方法，其中所述醇脱氢酶是MAH1。20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述C1代谢非光合微生物选自由以下各项组成的组：甲基单胞菌属(Methylomonas)、甲基细菌属(Methylobacter)、甲基球菌属(Methylococcus)、甲基弯曲菌属(Methylosinus)、甲基孢囊菌属(Methylocystis)、甲基微菌属(Methylomicrobium)、甲烷单胞菌属(Methanomonas)、嗜甲基菌属(Methylophilus)、甲基菌属(Methylobacillus)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、生丝微菌属(Hyphomicrobium)、黄色杆菌属(Xanthobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、副球菌属(Paracoccus)、诺卡氏菌属(Nocardia)、节杆菌属(Arthrobacter)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)和假单胞菌属(Pseudomonas)。21.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述C1代谢非光合微生物是细菌。22.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述C1代谢细菌是嗜甲烷菌(methanotroph)或嗜甲基菌(methylotroph)。23.根据权利要求22所述的方法，其中所述C1代谢细菌是嗜甲烷菌。24.根据权利要求23所述的方法，其中所述嗜甲烷菌是甲基单胞菌属、甲基细菌属、甲基球菌属、甲基弯曲菌属、甲基孢囊菌属、甲基微菌属、甲烷单胞菌属或其任意组合。25.根据权利要求24所述的方法，其中所述嗜甲烷菌是甲基单胞菌属16a(ATCCPTA2402)、丝孢甲基弯曲菌(Methylosinustrichosporium)(NRRLB-11,196)、生孢甲基弯曲菌(Methylosinussporium)(NRRLB-11,197)、小甲基孢囊菌(Methylocystisparvus)(NRRLB-11,198)、喜甲烷甲基单胞菌(Methylomonasmethanica)(NRRLB-11,199)、白甲基单胞菌(Methylomonasalbus)(NRRLB-11,200)、荚膜甲基细菌(Methylobactercapsulatus)(NRRLB-11,201)、嗜有机甲基杆菌(Methylobacteriumorganophilum)(ATCC27,886)、甲基单胞菌属(Methylomonassp.)AJ-3670(FERMP-2400)、Methylocellasilvestris、极端嗜酸甲烷氧化菌(Methylacidiphiluminfernorum)、Methylibiumpetroleiphilum或其任意组合。26.根据权利要求23所述的方法，其中所述嗜甲烷菌是丝孢甲基弯曲菌OB3b、荚膜甲基球菌(Methylococcuscapsulatus)Bath、甲基单胞菌属16a、嗜碱甲基微菌(Methylomicrobiumalcaliphilum)或其高生长变体。27.根据权利要求22至26中任一项所述的方法，其中所述培养还包含异种细菌。28.根据权利要求22所述的方法，其中所述C1代谢细菌是嗜甲基菌。29.根据权利要求28所述的方法，其中所述嗜甲基菌是扭脱甲基杆菌(Methylobacteriumextorquens)、耐辐射甲基杆菌(Methylobacteriumradiotolerans)、单胞甲基杆菌(Methylobacteriumpopuli)、氯甲烷甲基杆菌(Methylobacteriumchloromethanicum)、结瘤甲基杆菌(Methylobacteriumnodulans)或其任意组合。30.根据权利要求21至29中任一项所述的方法，其中所述C1代谢细菌是天然气、非常规天然气或合成气代谢细菌。31.根据权利要求30所述的方法，其中所述合成气代谢细菌是梭菌属(Clostridium)、穆尔氏菌属(Moorella)、热球菌属(Pyrococcus)、真杆菌属(Eubacterium)、脱硫杆菌属(Desulfobacterium)、氧化碳嗜热菌属(Carboxydothermus)、产醋菌属(Acetogenium)、醋酸杆菌属(Acetobacterium)、厌氧醋菌属(Acetoanaerobium)、丁酸杆菌属(Butyribaceterium)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)或其任意组合。32.根据权利要求30所述的方法，其中所述合成气代谢细菌是自产乙醇梭菌(Clostridiumautoethanogenum)、扬氏梭菌(Clostridiumljungdahli)、拉格利梭菌(Clostridiumragsdalei)、食氧化碳梭菌(Clostridiumcarboxydivorans)、食甲基丁酸杆菌(Butyribacteriummethylotrophicum)、伍氏梭菌(Clostridiumwoodii)、Clostridiumneopropanologen或其组合。33.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述C1代谢非光合微生物是专性C1代谢非光合微生物。34.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括编码硫酯酶的重组核酸分子。35.根据权利要求34所述的方法，其中所述硫酯酶是缺少信号肽的tesA、UcFatB或BTE。36.根据权利要求34或权利要求35所述的方法，其中与未改变的内源硫酯酶活性相比，内源硫酯酶活性降低、最小或被消除。37.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括编码酰基-辅酶A合酶的重组核酸分子。38.根据权利要求37所述的方法，其中所述酰基-辅...

【专利技术属性】
技术研发人员：洛林·琼·基弗，约书亚·西尔韦曼，约翰·H·格雷特，
申请(专利权)人：凯利斯塔公司，
类型：发明
国别省市：美国;US