以菊芋为原料的产油微生物生产微生物油脂的方法技术

本发明专利技术一种以菊芋为原料的产油微生物培养方法，包括步骤：制备种子培养基、菌体增殖培养、制备产油培养基、菌体油脂积累培养、提取产油微生物油脂等。本发明专利技术采用菊粉为原料制备培养基，价格低廉，适于大规模工业应用；根据菊芋水解液的特点、通过不同的处理方式，调整营养元素的含量，开发出限磷/硫调控结合两阶段培养的产油微生物培养技术，显著提高菌体增殖速率及产油微生物的油脂积累速率，油脂产量明显提高；本发明专利技术方法的应用扩展了生物柴油的油脂原料来源，可显著缩短生产周期，降低生产成本，提高了生产效率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及含油微生物培养及微生物油脂生产
，具体的说，涉及以菊粉为原料、限磷/硫调控结合两阶段法培养含油微生物并利用该类微生物生产微生物油脂的方法。
技术介绍
微生物油脂(microbialoil)又称单细胞油脂(singlecelloil,SCO)，是由酵母、霉菌、细菌和藻类等产油微生物利用碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂为碳源、氮源、辅以无机盐在一定条件下生产的油脂。相对于动植物油脂，微生物油脂生产周期短，不受季节与气候限制，原料来源广，基本不占用额外耕地资源，易于实现规模生产，被认为是很有潜力的新型油脂资源。因此，微生物油脂不仅可能作为食用油或其它功能性油脂的替代品，还可能在可再生液体燃料生物柴油产业发展中发挥重要作用。产油微生物油脂积累过程是一个高度依赖生长环境的生物过程，尤其是营养可得性。早期研究表明，产油微生物在培养基中的碳源过量而其它营养元素不足的条件下能将多余的碳源储存为胞内油脂，这些限制性营养元素包括氮、磷、锌、铁和镁等。至今为止，氮源限制是促发微生物积累油脂的最普遍手段，通常采用较高的C/N比来实现。如当培养基中的C/N比从83.5上升到133.5时，深黄被孢霉的油脂含量从原来的50.0％增加到56.0％；刺孢小克银汉霉(Cunninghamellaechinulata)的油脂含量从36.0％增加到47.0％(PapanikolaouS.,etal.JournalofAppliedMicrobiology,2004,97(4):867-875.)。此外，也有人尝试采用磷元素限制或者硫元素限制等方式，提高微生物积累油脂的能力。例如吴思国等在研究圆红冬孢酵母积累油新方法，采用磷元素限制的方式，调控微生物油脂的含量，结果表明，当C/P从72上升到9552时微生物油脂的含量从21.2％上升到62.1％；采用硫元素限制方式能够取得类似结果，当C/S从150上升到18310时微生物油脂的含量从20.8％到55.8％。天然原料往往都富含氮，由于脱氮比脱磷或者脱硫的难度更大、成本更高，因此采用磷元素限制和硫元素限制替代氮元素限制，不失为一种行之有效的调控微生物油脂积累的方式。菊芋又名洋姜、鬼子姜，适于生长在滩涂地、盐碱地；产量大，其块茎干物质亩产可达1.2吨，茎叶干重1.3吨以上，超过玉米和小麦的生物量单产水平。菊芋块茎中菊粉含量很高，可占湿重的20％左右、干重的80％左右，而菊粉为多聚果糖，易于转化为可发酵的果糖，可直接被微生物利用。因此，采用菊芋为微生物发酵原料生产生物柴油，可实现不与粮挣地，又符合我国生物柴油发展的产业政策。然而，菊芋应用于微生物油脂生产面临含氮量过高、菌体生长缓慢、目标产物得率不高等问题，不利于大规模工业化生产。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，开发一种以菊芋为原料的产油微生物培养方法，该方法可以提高菌体油脂积累速度，实现油脂的高效合成；解决菊芋原料除氮元素困难，无法采用限氮调控积累油脂的问题，进一步提高油脂生产强度和底物转化率，实现培养原料的有效利用，降低生产成本，改善微生物油脂发酵技术经济性的目的，实现大规模工业化生产。为达到上述目的，本专利技术提供了一种以菊芋为原料的产油微生物生产微生物油脂的方法，包括如下步骤：S1、制备菊芋水解液：将菊粉与水按质量比1:1～10混合，采用3mol/L盐酸调节pH至1～4；饱和蒸汽下水解10～40min，调节pH至中性，得到菊芋水解液；S2、制备种子培养基：取步骤S1制得的菊芋水解液的二分之一，添加氮源至1～20g/L，添加磷酸二氢钾至1.0g/L，添加MgSO4·7H2O至0.5g/L，灭菌，得到微生物的种子培养基；S3、菌体增殖培养：以10％(V/V)接种量接入产油微生物种子液(OD600nm＝1～10)于步骤S1制得的种子培养基中，在20～40℃、转速为40～800rpm条件下，通气培养12～96h，离心分离，收集菌体，即为增殖后的产油微生物菌体；上述菌体增殖培养过程在摇床里进行，摇床的转速为40～800rpm；S4、制备产油培养基：将步骤S1制得的菊芋水解液剩余的二分之一进行脱磷处理，得到碳元素与磷元素摩尔比率(C/P)大于70的除磷产油培养基；或将步骤S1制得的菊芋水解液剩余的二分之一进行脱硫处理，得到碳元素与硫元素摩尔比率(C/S)大于150的除硫产油培养基；S5、菌体油脂积累培养：将步骤S3制得的增殖后的产油微生物菌体接种于步骤S4制得的除磷产油培养基或除硫产油培养基中；在20～40℃、pH值为3.0～8.0、转速为40～800rpm条件下培养48～168h，收集菌体，即为含油的产油微生物菌体，于105℃烘干至恒重，得到产油微生物干菌体；上述菌体增殖培养过程在摇床里进行，摇床的转速为40～800rpm；S6、提取产油微生物油脂：提取步骤S5得到的产油微生物干菌体中的油脂，得到产油微生物油脂。优选方式下，步骤S1所述菊粉的粒度为50～200目。优选方式下，步骤S2所述氮源为酵母提取物、蛋白胨、NH4NO3、(NH4)2SO4中的一种或几种组合。优选方式下，步骤S3所述产油微生物为所述产油微生物为经发酵培养后、微生物胞内油脂含量大于其细胞干重20wt％的真核或原核微生物；包括产油细菌、产油真菌、产油霉菌、产油微藻。上述产油细菌、产油真菌、产油霉菌、产油微藻包括人工及自然突变菌株。最优方式下，所述产油细菌为Arthrobacter属、Rhodococcus属或Mycobacterium属；所述产油真菌为Rhodosporidium属、Cryptococcuscur属、Yarrowia属、Rhodotorula属、Rhizopus属、Lipomyces属、Trichosporon属、Mortierella属、Mucor属或Cunninghamella属；所述产油霉菌为Mortierella属、Cunninghamella属、Mucor属或Aspergillus属；所述产油微藻为Crypthecodinium属、Botryococcus属、Chlorella属、Nannochloropsis属、Haliphthoros属或Schizochytrium属。优选方式下，步骤S4所述脱磷处理采用化学沉淀法。具体操作方法参考文献：徐建宇,宫宇宙,潘明富.几种混凝剂深度除磷性能的对比研究.广西轻工业,2009,(1),89-91；黄自力,肖晶晶,李密.化学沉淀本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种以菊芋为原料的产油微生物生产微生物油脂的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、制备菊芋水解液：将菊粉与水按质量比1:1～10混合，采用3mol/L盐酸调节pH至1～4；饱和蒸汽下水解10～40min，调节pH至中性，得到菊芋水解液；S2、制备种子培养基：取步骤S1制得的菊芋水解液的二分之一，添加氮源至1～20g/L，添加磷酸二氢钾至1.0g/L，添加MgSO4·7H2O至0.5g/L，灭菌，得到微生物的种子培养基；S3、菌体增殖培养：以10％(V/V)接种量接入产油微生物种子液(OD600nm＝1～10)于步骤S1制得的种子培养基中，在20～40℃、转速为40～800rpm条件下，通气培养12～96h，离心分离，收集菌体，即为增殖后的产油微生物菌体；S4、制备产油培养基：将步骤S1制得的菊芋水解液剩余的二分之一进行脱磷处理，得到碳元素与磷元素摩尔比率大于70的除磷产油培养基；或将步骤S1制得的菊芋水解液剩余的二分之一进行脱硫处理，得到碳元素与硫元素摩尔比率大于150的除硫产油培养基；S5、菌体油脂积累培养：将步骤S3制得的增殖后的产油微生物菌体接种于步骤S4制得的除磷产油培养基或除硫产油培养基中；在20～40℃、pH值为3.0～8.0、转速为40～800rpm条件下培养48～168h，收集菌体，即为含油的产油微生物菌体，于105℃烘干至恒重，得到产油微生物干菌体；S6、提取产油微生物油脂：提取步骤S5得到的产油微生物干菌体中的油脂，得到产油微生物油脂。...

【技术特征摘要】
1.一种以菊芋为原料的产油微生物生产微生物油脂的方法，其特征在于，
包括如下步骤：
S1、制备菊芋水解液：将菊粉与水按质量比1:1～10混合，采用3mol/L盐酸
调节pH至1～4；饱和蒸汽下水解10～40min，调节pH至中性，得到菊芋水解液；
S2、制备种子培养基：取步骤S1制得的菊芋水解液的二分之一，添加氮源
至1～20g/L，添加磷酸二氢钾至1.0g/L，添加MgSO4·7H2O至0.5g/L，灭菌，得
到微生物的种子培养基；
S3、菌体增殖培养：以10％(V/V)接种量接入产油微生物种子液
(OD600nm＝1～10)于步骤S1制得的种子培养基中，在20～40℃、转速为
40～800rpm条件下，通气培养12～96h，离心分离，收集菌体，即为增殖后的产
油微生物菌体；
S4、制备产油培养基：将步骤S1制得的菊芋水解液剩余的二分之一进行脱
磷处理，得到碳元素与磷元素摩尔比率大于70的除磷产油培养基；
或将步骤S1制得的菊芋水解液剩余的二分之一进行脱硫处理，得到碳元素
与硫元素摩尔比率大于150的除硫产油培养基；
S5、菌体油脂积累培养：将步骤S3制得的增殖后的产油微生物菌体接种于
步骤S4制得的除磷产油培养基或除硫产油培养基中；在20～40℃、pH值为
3.0～8.0、转速为40～800rpm条件下培养48～168h，收集菌体，即为含油的产油
微生物菌体，于105℃烘干至恒重，得到产油微生物干菌体；
S6、提取产油微生物油脂：提取步骤S5得到的产油微生物干菌体中的油
脂，得到产油微生物油脂。
2.根据权利要求1所述以菊芋为原料的产油微生物生产微生物油脂的方法，
其特征在于，步骤S1所述菊粉的粒度为50～200目。
3.根据权利要求1所述以菊芋为原料的产油微生物生产微生物油脂的方法，
其特征在于，步骤S2所述氮源为酵母提取物、蛋白胨、NH4NO3、(NH4)2SO4中
的一种或几种组合。
4.根据权利要求1所述以菊芋为原料的产油微生物生产微生物油脂的方法，
其特征在于，步骤S3所述产油微生物为所述产油微生物为经发酵培养后、微生
物胞内油脂含量大于其细...

【专利技术属性】
技术研发人员：林心萍，谢同舟，高宁，孙黎明，纪超凡，刘洒洒，朱容仟，
申请(专利权)人：大连工业大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21