【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于固定化酶制备，具体涉及一种磷脂酶d的自组装固定化方法。
技术介绍
1、磷脂酶d(pld)是一类磷脂水解酶，可以发生水解和转酯两种类型的反应，在诸多领域具有广泛应用。例如，在食品医药行业中，pld水解磷脂产生磷脂酸(phosphatidicacid，pa)，pa添加在保健食品中可以作为肌酸补充剂。pa已被证明可以增强体内的雷帕霉素靶标mtor信号，mtor信号通路在维持细胞和生理稳态方面具有核心调控作用。在化工行业中，pld通常用来催化磷脂生成磷脂衍生物，磷脂衍生物可作为天然乳化剂、表面活性剂、食品稳定剂和洗涤剂，如磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，ps)可改善老年痴呆患者的认知障碍。此外，ps是一种有效的运动营养补充剂，可以对抗运动引起的压力，并通过抑制运动引起的皮质醇水平的升高来防止生理恶化。近年来，通过pld开发出许多具有抗癌和抗氧化活性的新型磷脂，如磷脂酰巴蒂尔、磷脂酰葡萄糖。因此，pld在食品、化工、医药等行业均有广泛的应用。但由于在反应过程中，游离酶容易成为产品杂质、分离成本高、稳定性差、不可循环再利用，限制了游离酶的使用。通过固定化技术可以有效改善以上问题，并增强了酶的操作稳定性、提高了可重复利用性，从而提高经济效益。
2、酶固定化的主要目的是提高生物催化过程的经济性，使酶制剂可以在较长时间内重复使用，并使催化剂与产物更容易分离。但是，酶的稳定性在很大程度上取决于固定化策略。与传统的方法相比，有机-无机杂化纳米花(organic-inorganic hybridnanofl
技术实现思路
1、为弥补现有技术不足，本专利技术提供一种磷脂酶d的自组装固定化方法。
2、本专利技术的专利技术点如下：本专利技术利用贻贝材料可以强烈地附着在各种基材上，其主要成分儿茶酚及其衍生物都能通过氧化自聚或与金属离子络合形成稳固的功能性粘附膜。在用贻贝粘附蛋白(mussel adhesiveproteins,maps)修饰的磁性纳米颗粒的基础上，通过酶与无机组分的自组装形成具有磁性的有机-无机杂化纳米花。制备纳米催化剂的反应条件温和无毒、高效环保，所得固定化酶的蛋白负载量大、稳定性和催化活性显著提高，实现酶的可回收再利用。
3、为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
4、一种磷脂酶d的自组装固定化方法，将pld溶液与缓冲液或者含有磁性纳米颗粒的缓冲液混匀，加入金属离子缓冲液孵育，离心、分离、洗涤得到固定化酶；所述金属离子包括不限于cu2+、ca2+、zn2+。
5、所述的孵育条件是：在37℃培养箱中孵育48h。
6、所述的磁性纳米颗粒为磁性纳米fe3o4，该磁性纳米颗粒还可以用多酚化合物进行修饰。
7、所述的修饰方法为：磁性纳米fe3o4与多酚类化合物(如多巴胺、单宁酸等)反应，得到多酚化合物修饰的磁性纳米颗粒。磁性纳米fe3o4分散液浓度为：0.5-5mg/ml；多巴胺或单宁酸为：1-5mg/ml。
8、作为本专利技术第一个优选的实施例，磷脂酶d的自组装固定化采用如下方法：pld溶液与pbs溶液混匀，加入金属离子孵育，离心、分离上清、洗涤，得到pld-无机杂化纳米花。
9、更进一步的，该方法具体为：取160μlpbs溶液(ph＝7.4)，在pbs溶液中添加10-50μlpld溶液，混匀后，加入10-50μl金属离子，在37℃培养箱中孵育48h。孵育后，1000rpm离心3min，将沉淀和上清液分离，取出上清液，以备后面使用，向沉淀中加入适量去离子水进行洗涤，反复洗涤三次，去掉上清，得到固定化酶，即pld-无机杂化纳米花。
10、作为本专利技术第二个优选的实施例，磷脂酶d的自组装固定化采用如下方法：
11、磁性纳米颗粒均匀分散在pbs、tris-hcl等缓冲液中，在含有磁性纳米颗粒的缓冲液中添加pld，混匀后，加入金属离子缓冲溶液(cu2+、ca2+、zn2+等)，在37℃培养箱中孵育48h，得到磁性纳米花，将磁性纳米花用超纯水反复洗涤，通过外加磁场将得到的固定化酶分离出来，得到磁性纳米花固定化酶。
12、作为本专利技术第三个优选的实施例，磷脂酶d的自组装固定化还可以采用如下方法：
13、多酚化合物修饰的磁性纳米颗粒均匀分散在pbs、tris-hcl等缓冲液中，在含有多酚化合物修饰的磁性纳米颗粒缓冲液中添加pld，混匀后，加入金属离子缓冲溶液(cu2+、ca2+、zn2+等)，在37℃培养箱中孵育48h。将磁性纳米花用超纯水反复洗涤，通过外加磁场将得到的固定化酶分离出来，得到多酚化合物修饰的磁性纳米花固定化酶。
14、该方法中，将多酚化合物包覆在磁性四氧化三铁表面再与纳米花复合，缓解磁性纳米颗粒对酶活性的影响，从而得到具有高酶活性，可回收利用性强的磁性纳米花。
15、更进一步的，该方法具体为：在1l 10mmol/ltris-hcl溶液中，加入磁性纳米fe3o4分散液使其终浓度为0.5-5mg/ml，并超声15min，得到均匀分散的磁性纳米粒子，向混合液中添加1-5g盐酸多巴胺，在25℃下持续剧烈搅拌12h，使聚多巴胺通过自聚合反应修饰到fe3o4表面，反应结束后用超纯水洗涤pda-mnps三次，除去产物中未反应的盐酸多巴胺，洗涤后将制备的pda-mnps在80℃真空干燥12h至恒重；
16、将0.5-2mg/ml pda-mnps添加到10mm pbs溶液(ph＝7.4)中，使pda-mnps均匀分散在缓冲液中，在混合溶液中添加50-500μlpld，混匀后，加入50-500μl金属离子缓冲溶液(cu2+、ca2+、zn2+等)，在37℃培养箱中孵育48h，得到pda-mnfs。
17、将以上方法得到的pld-磁性纳米花用超纯水反复洗涤三次，通过外加磁场将得到的pda-mnfs分离出来。
18、作为一种替换方案，多酚化合物修饰的磁性纳米颗粒还可以为：在40ml蒸馏水中加入磁性纳米fe3o4分散液使其终浓度为0.5-5mg/ml，并超声20min得到均匀分散的磁性纳米粒子，通入n2，200rpm 40℃持续搅拌1h，再加入1-5g单宁酸继续搅拌2h。待反应结束后冷却至室温。外加磁场收集制备的ta-fe3o4，收集物先后用乙醇和去离子水洗涤三次。最后在70℃真空干燥箱中干燥过夜，得到ta-mnps。
19、将0.5本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种磷脂酶D的自组装固定化方法，其特征在于，将PLD溶液与缓冲液或者含有磁性纳米颗粒的缓冲液混匀，加入金属离子缓冲液孵育，离心、分离、洗涤得到固定化酶；所述金属离子包括不限于Cu2+、Ca2+、Zn2+。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的孵育条件是：在37℃培养箱中孵育48h。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的磁性纳米颗粒为磁性纳米Fe3O4。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该磁性纳米颗粒还可以用多酚化合物进行修饰。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的修饰方法为：磁性纳米Fe3O4与多酚类化合物反应，得到多酚化合物修饰的磁性纳米颗粒；磁性纳米Fe3O4分散液浓度为：0.5-5mg/mL；多酚化合物浓度为：1-5mg/mL。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，磷脂酶D的自组装固定化采用如下方法：PLD溶液与PBS溶液混匀，加入金属离子孵育，离心、分离上清、洗涤，得到PLD-无机杂化纳米花。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，该方法具体
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，磷脂酶D的自组装固定化采用如下方法：
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，磷脂酶D的自组装固定化还可以采用如下方法：
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，该方法具体为：在1L 10mmol/LTris-HCl溶液中，加入磁性纳米Fe3O4分散液使其终浓度为0.5-5mg/mL，并超声15-20min，得到均匀分散的磁性纳米粒子，向混合液中添加1-5g盐酸多巴胺或单宁酸，在25℃下持续剧烈搅拌12h，使多巴胺或单宁酸通过自聚合反应修饰到Fe3O4表面，反应结束后用超纯水洗涤PDA-MNPs或TA-MNPs三次，除去产物中未反应的盐酸多巴胺或TA，洗涤后将制备的PDA-MNPs或TA-MNPs在80℃真空干燥12h至恒重；
...【技术特征摘要】
1.一种磷脂酶d的自组装固定化方法，其特征在于，将pld溶液与缓冲液或者含有磁性纳米颗粒的缓冲液混匀，加入金属离子缓冲液孵育，离心、分离、洗涤得到固定化酶；所述金属离子包括不限于cu2+、ca2+、zn2+。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的孵育条件是：在37℃培养箱中孵育48h。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的磁性纳米颗粒为磁性纳米fe3o4。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该磁性纳米颗粒还可以用多酚化合物进行修饰。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的修饰方法为：磁性纳米fe3o4与多酚类化合物反应，得到多酚化合物修饰的磁性纳米颗粒；磁性纳米fe3o4分散液浓度为：0.5-5mg/ml；多酚化合物浓度为：1-5mg/ml。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，磷脂酶d的自组装固定化采用如下方法：pld溶液与pbs溶液混匀，加入金属离子孵育，离心、分离上清、洗涤，得到pld-无机杂化纳米花。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，该方法具体为：取160μlpbs溶液p...
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