用于生物合成化合物的方法、试剂和细胞技术

本文件描述了使用脂肪酸O‑甲基转移酶，硫酯酶，CoA‑转移酶和CoA连接酶中的一种或多种从前体如2‑酮戊二酸生成2,3‑脱氢己二酰‑CoA甲酯的生物化学途径，以及表达一种或多种此类酶的重组宿主。可以使用反式‑2‑烯酰基‑CoA还原酶和甲基酯酶将2,3‑脱氢己二酰CoA甲酯酶促转化成己二酰‑CoA，其继而可以酶促转化为己二酸，6‑氨基己酸，6‑羟基己酸，己内酰胺，六亚甲基二胺或1,6‑己二醇。

Methods, reagents, and cells for biosynthesis of compounds

This document describes the use of O fatty acid methyltransferase, thioesterase, biochemical pathways of CoA transfer of one or more enzymes and CoA ligase in precursor such as 2 ketoglutaric acid methyl ester 2,3 has generated two acyl CoA dehydrogenation, as well as the expression of one or more of these enzymes in recombinant host. You can use the trans 2 enoyl reductase and CoA methyl esterase 2,3 dehydrogenation has two acyl methyl CoA enzymatic conversion into two acyl CoA, which in turn can be converted to adipic acid enzymatic, 6 aminocaproic acid, 6 3-hydroxyhexanoate, caprolactam, six methylene amine or two 1,6 hexandiol.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于生物合成化合物的方法、试剂和细胞对相关申请的交叉引用本申请要求均于2014年6月16日提交的美国申请号62/012,674和62/012,735的权益，其公开内容通过引用全部并入本文。
本专利技术涉及使用具有脂肪酸O-甲基转移酶活性的多肽在重组宿主中屏蔽用末端羧基基团官能化的碳链脂肪族主链的方法。本专利技术还涉及使用以下一种或多种在宿主中生物合成2,3-脱氢己二酰CoA甲酯的方法：(i)具有脂肪酸O-甲基转移酶活性的多肽，(ii)具有硫酯酶活性或CoA转移酶活性的多肽，或(iii)具有CoA连接酶活性的多肽，以及表达一种或多种此类外源性酶的重组宿主细胞。本专利技术还涉及使用具有反式烯酰基-CoA还原酶活性的多肽和/或具有庚二酰基-[acp]甲酯酯酶活性的多肽将2,3-脱氢己二酰基-CoA甲酯酶促转化成己二酰-CoA的方法，以及表达一种或多种此类外源性酶的重组宿主细胞。此外，本专利技术还涉及将己二酰-CoA酶促转化成己二酸，6-氨基己酸，六亚甲基二胺，己内酰胺，6-羟基己酸和1,6-己二醇(下文称为“C6构件块”)中的一种或多种及产生此类C6构件块的重组宿主。专利技术背景尼龙是聚酰胺，其有时通过二胺与二羧酸的缩合聚合(condensationpolymerisation)合成。类似地，可以通过内酰胺的缩合聚合生成尼龙。一种普遍存在的尼龙是尼龙6,6，其通过六亚甲基二胺(HMD)和己二酸的反应生成。通过己内酰胺的开环聚合生成尼龙6。因此，己二酸，六亚甲基二胺和己内酰胺是生产尼龙的重要中间体(Anton&Baird,PolyamidesFibers,EncyclopediaofPolymerScienceandTechnology,2001)。在工业上，己二酸和己内酰胺通过环己烷的空气氧化产生。环己烷的空气氧化在一系列步骤中产生称为KA油的环己酮(K)和环己醇(A)的混合物。KA油的硝酸氧化产生己二酸(Musser,Adipicacid,Ullmann’sEncyclopediaofIndustrialChemistry,2000)。己内酰胺通过其肟和随后的酸重排由环己酮产生(Fuchs,KieczkaandMoran,Caprolactam,Ullmann’sEncyclopediaofIndustrialChemistry,2000)。在工业上，通过将C6构件块氢氰化为己二腈，然后氢化成HMD来制备六亚甲基二胺(HMD)(HerzogandSmiley,Hexamethylenediamine,Ullmann’sEncyclopediaofIndustrialChemistry,2012)。鉴于对石油化学原料的依赖性，生物技术通过生物催化提供了备选方法。生物催化是使用生物催化剂，如酶，来进行有机化合物的生物化学转化。生物衍生的原料和石油化学原料两者都是用于生物催化过程的可行的起始材料。因此，针对这种背景，显然需要生产己二酸，己内酰胺，6-氨基己酸，六亚甲基二胺和1,6-己二醇(下文称为“C6构件块”)的可持续方法，其中所述方法是基于生物催化剂的(Jangetal.,Biotechnology&Bioengineering,2012,109(10),2437–2459)。然而，没有野生型原核生物或真核生物天然过度产生或排出C6构件块到细胞外环境。然而，已经报道了己二酸和己内酰胺的代谢(Ramsayetal.,Appl.Environ.Microbiol.,1986,52(1),152–156；KulkarniandKanekar,CurrentMicrobiology,1998,37,191–194)。二羧酸己二酸通过许多细菌和酵母经由β-氧化作为碳源有效地转化为中心代谢物。己二酸到3-氧代己二酸的β-氧化促进通过例如与芳族底物降解相关的邻位裂解途径的进一步分解代谢。已经全面表征了几种细菌和真菌将3-氧代己二酰-CoA分解代谢为乙酰CoA和琥珀酰-CoA(HarwoodandParales,AnnualReviewofMicrobiology,1996,50,553–590)。己二酸和6-氨基己酸都是己内酰胺分解代谢中的中间体，最终通过3-氧代己二酰-CoA降解为中心代谢物。已经提出了从生物质-糖产生己二酸的潜在代谢途径：(1)通过邻位裂解芳族降解途径从葡萄糖以生物化学方式到顺式，顺式粘康酸，随后通过化学催化到己二酸；(2)通过琥珀酰-CoA和乙酰-CoA的缩合的可逆的己二酸降解途径；和(3)组合β-氧化，脂肪酸合酶和ω-氧化。然而，没有报道使用这些策略的信息(Jangetal.,Biotechnology&Bioengineering,2012,109(10),2437–2459)。最优性原理叙述，微生物调节它们的生物化学网络来支持最大生物质(biomass)生长。超出在宿主生物体中表达异源途径的需要，将碳通量引导到充当碳源的C6构件块而非生物质生长组分与最优性原理矛盾。例如，将1-丁醇途径从梭菌属(Clostridium)物种转移至其它生产菌株与天然生产者的生产性能相比经常相差一个数量级(Shenetal.,Appl.Environ.Microbiol.,2011,77(9),2905–2915)。6碳脂肪族主链作为有效前体的有效合成是在C6脂肪族主链上形成末端官能团，如羧基，胺或羟基基团前合成C6构件块的关键考虑。专利技术概述本文件至少部分基于如下的发现，即可以通过2,3-脱氢己二酰-CoA甲酯构建生物化学途径以产生六碳链脂肪族主链前体，其中可以形成一个或两个官能团，即羧基，胺或羟基，从而导致己二酸，6-氨基己酸，6-羟基己酸，己内酰胺，六亚甲基二胺或1,6-己二醇(下文称为“C6构件块”)的合成。己二酸盐和己二酸，6-羟基己酸盐和6-羟基己酸，和6-氨基己酸和6-氨基己酸盐在本文中可互换使用，是指任何其中性或离子化形式的相关化合物，包括其任何盐形式。本领域技术人员应当理解，具体形式将取决于pH。本文所述的这些途径，代谢工程和培养策略依赖于使用例如脂肪酸O-甲基转移酶从2,3-脱氢己二酸生成2,3-脱氢己二酸甲酯，并且使用例如CoA连接酶从2,3-脱氢己二酸甲酯生成2,3-脱氢己二酰-CoA甲酯。可以使用例如反式-2-烯酰基-CoA还原酶和庚二酰-[acp]甲酯酯酶从2,3-脱氢己二酰-CoA甲酯生成己二酰-CoA。可以例如由(i)2-酮戊二酸或琥珀酰-CoA，或(ii)从2-氧代己二酸生成2,3-脱氢己二酸，如分别在图1和2中所示。面对最优性原理，已经令人惊讶地发现，可以组合合适的非天然途径，原料，宿主微生物，对宿主生物化学网络的减弱策略和培养策略，以有效地产生一个或多个C6构件块。在一些实施方案中，可以使用硫酯酶，醛脱氢酶，7-氧代庚酸脱氢酶，6-氧代己酸脱氢酶，5-氧代戊酸脱氢酶，可逆的CoA-连接酶(例如，可逆的琥珀酰-CoA连接酶)，或CoA转移酶(例如，戊烯二酸CoA转移酶)酶促形成末端基团。参见图3。在一些实施方案中，可以使用ω-转氨酶或脱乙酰酶来酶促形成末端胺基。参见图4、5和6。在一些实施方案中，可以使用4-羟基丁酸脱氢酶，5-羟基戊酸脱氢酶，6-羟基己酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
在重组宿主中屏蔽用末端羧基基团官能化的碳链脂肪族主链的方法，所述方法包括：使用具有脂肪酸O‑甲基转移酶活性的多肽在所述宿主中将n‑羧基‑2‑烯酸酶促转化成n‑羧基‑2‑烯酸甲酯，其中n+1反映所述碳链脂肪族主链的长度。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.06.16 US 62/012,735;2014.06.16 US 62/012,6741.在重组宿主中屏蔽用末端羧基基团官能化的碳链脂肪族主链的方法，所述方法包括：使用具有脂肪酸O-甲基转移酶活性的多肽在所述宿主中将n-羧基-2-烯酸酶促转化成n-羧基-2-烯酸甲酯，其中n+1反映所述碳链脂肪族主链的长度。2.权利要求1的方法，其中所述n-羧基-2-烯酸是2,3-脱氢己二酸。3.权利要求1的方法，其中所述n-羧基-2-烯酸甲酯是2,3-脱氢己二酸甲酯，所述方法还包括将2,3-脱氢己二酸甲酯酶促转化成己二酰CoA。4.权利要求3的方法，所述方法还包括将己二酰-CoA酶促转化成选自下组的产物：己二酸，6-氨基己酸，6-羟基己酸，己内酰胺，己二胺和1,6己二醇。5.权利要求4的方法，其中使用一种或多种多肽将己二酰-CoA转化为所述产物：所述多肽具有硫酯酶，可逆性CoA连接酶，戊烯二酸CoA转移酶，ω-转氨酶，6-羟基己酸脱氢酶，5-羟基戊酸脱氢酶，4-羟基戊酸脱氢酶，醇脱氢酶，羧酸还原酶或醇脱氢酶活性。6.在重组宿主中生成2,3-脱氢己二酰-CoA甲酯的方法，所述方法包括：使用具有脂肪酸O-甲基转移酶活性的多肽将2,3-脱氢己二酸酶促转化为2,3-脱氢己二酸甲酯。7.权利要求6的方法，所述方法还包括将2,3-脱氢己二酸甲酯酶促转化成己二酰-CoA甲酯。8.权利要求6的方法，其中从2,3-脱氢己二酰-CoA酶促生成2,3-脱氢己二酸。9.权利要求8的方法，其中具有硫酯酶或CoA转移酶活性的多肽将2,3-脱氢己二酰CoA酶促转化为2,3-脱氢己二酸。10.权利要求9的方法，其中所述具有硫酯酶活性的多肽与SEQIDNO:4或SEQIDNO:5所示的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。11.权利要求9的方法，其中所述具有CoA转移酶活性的多肽与SEQIDNO:24或SEQIDNO:25所示的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。12.权利要求1至11中任一项的方法，其中所述具有脂肪酸O-甲基转移酶活性的多肽分类在EC2.1.1.15下。13.权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述具有脂肪酸O-甲基转移酶活性的多肽与SEQIDNO:1，SEQIDNO:2，或SEQIDNO:3所示的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。14.权利要求6的方法，其中使用EC6.2.1.-下分类的具有CoA连接酶活性的多肽将2,3-脱氢己二酸甲酯酶促转化成2,3-脱氢己二酰-CoA甲酯。15.权利要求14的方法，其中所述具有CoA连接酶活性的多肽分类在EC6.2.1.2或EC6.2.1.3下。16.权利要求14或15的方法，所述方法还包括将2,3-脱氢己二酰-CoA甲酯酶促转化成己二酰-CoA甲酯。17.权利要求16的方法，其中具有反式-2-烯酰基-CoA还原酶活性的多肽将2,3-脱氢己二酰-CoA甲酯酶促转化成己二酰-CoA甲酯。18.权利要求16或权利要求17的方法，所述方法还包括将己二酰-CoA甲酯酶促转化成己二酰-CoA。19.权利要求18的方法，其中具有庚二酰-[acp]甲酯酯酶(pimelyl-[acp]methylesteresterase)活性的多肽将己二酰-CoA甲酯酶促转化成己二酰-CoA。20.权利要求19的方法，其中所述具有庚二酰-[acp]甲酯酯酶活性的多肽与SEQIDNO:6所示的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。21.权利要求18至20中任一项所述的方法，所述方法还包括将己二酰-CoA酶促转化成选自下组的产物：己二酸，6-氨基己酸酯，6-羟基己酸酯，己内酰胺，六亚甲基二胺和1,6-己二醇。22.权利要求21的方法，其中所述方法包括使用具有硫酯酶，可逆的CoA-连接酶或戊烯二酸CoA转移酶活性的多肽将己二酰CoA酶促转化成己二酸。23.权利要求22的方法，其中所述方法还包括使用具有羧酸还原酶活性的多肽将己二酸酶促转化成己二酸半醛。24.权利要求21的方法，其中所述方法包括使用具有乙酰化醛脱氢酶活性的多肽将己二酰-CoA酶促转化成己二酸半醛。25.权利要求23或权利要求24的方法，所述方法还包括使用具有5-氧代戊酸脱氢酶，6-氧代己酸脱氢酶，7-氧代庚酸脱氢酶或醛脱氢酶活性的多肽将己二酸半醛酶促转化为己二酸。26.权利要求23或权利要求24的方法，所述方法还包括使用具有ω-转氨酶活性的多肽将己二酸半醛酶促转化为6-氨基己酸。27.权利要求23或权利要求24的方法，所述方法还包括使用具有ω-转氨酶和/或羧酸还原酶活性的多肽将己二酸半醛酶促转化为六亚甲基二胺。28.权利要求23或权利要求24的方法，所述方法还包括使用具有6-羟基己酸脱氢酶，5-羟基戊酸脱氢酶，4-羟基丁酸脱氢酶或醇脱氢酶活性的多肽将己二酸半醛酶促转化为6-羟基己酸。29.权利要求28的方法，所述方法还包括使用具有羧酸还原酶和醇脱氢酶活性的多肽将6-羟基己酸酶促转化为1,6-己二醇。30.前述权利要求中任一项的方法，其中通过发酵进行所述方法的一个或多个步骤。31.权利要求1至30中任一项的方法，其中所述宿主经受在需氧，厌氧，微需氧或混合氧/反硝化培养条件下的培养策略。32.权利要求1至31中任一项的方法，其中所述宿主在磷酸盐，氧和/或氮限制的条件下培养。33.权利要求1至32中任一项的方法，其中使用陶瓷膜保留所述宿主以在发酵期间维持高细胞密度。34.权利要求30的方法，其中供给所述发酵的主要碳源源自生物或非生物原料。35.权利要求34的方法，其中所述生物原料是或源自单糖，二糖，木质纤维素，半纤维素，纤维素，木质素，乙酰丙酸，甲酸，甘油三酯，甘油，脂肪酸，农业废物，浓缩酒糟(condenseddistillers’solubles)，或城市废物。36.权利要求34的方法，其中所述非生物原料是或源自天然气、合成气、CO2/H2、甲醇、乙醇、苯甲酸盐、来自环己烷氧化过程的非挥发性残留物(NVR)碱洗液(causticwash)废物流、或对苯二甲酸/异酞酸混合物废物流。37.权利要求29至36中任一项的方法，其中所述宿主包含一种或多种多肽，所述多肽具有减弱的聚羟基烷酸酯合酶、乙酰基-CoA硫酯酶、乙酰基-CoA特异性β-酮硫解酶、形成乙酸的磷酸乙酸转移酶、乙酸激酶、乳酸脱氢酶、menaquinol-延胡索酸氧化还原酶、形成乙醇的醇脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、丙酮酸脱羧酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、消散NADPH不平衡的转氢酶、消散NADPH不平衡的谷氨酸脱氢酶、利用NADH/NADPH的谷氨酸脱氢酶、庚二酰-CoA脱氢酶；接受C7构件块和中心前体作为底物的酰基-CoA脱氢酶；戊二酰-CoA脱氢酶；或己二酰基-CoA合成酶活性。38.权利要求29至37中任一项的方法，其中所述宿主过表达一种或多种编码多肽的基因，所述多肽具有乙酰基-CoA合成酶；6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶；转酮醇酶；吡啶(puridine)核苷酸转氢酶；甲酸脱氢酶；甘油醛-3P-脱氢酶；苹果酸酶；葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；果糖1,6二磷酸酶；L-丙氨酸脱氢酶；PEP羧化酶，丙酮酸羧化酶；PEP羧激酶；PEP合酶；对NADPH特异性的L-谷氨酸脱氢酶，用于产生辅因子不平衡；甲醇脱氢酶，甲醛脱氢酶，赖氨酸转运蛋白；二羧酸转运蛋白；S-腺苷甲硫氨酸合成酶；3-磷酸甘油酸脱氢酶；3-磷酸丝氨酸氨基转移酶；磷酸丝氨酸磷酸酶；或多药物转运蛋白活性。39.权利要求1至38中任一项的方法，其中所述宿主是原核生物。40.权利要求39的方法，其中所述原核生物选自下组：埃希氏菌属(Escherichia)；梭菌属(Clostridia)；棒状杆菌属(C...

【专利技术属性】
技术研发人员：AL博特斯，AVE康拉迪，
申请(专利权)人：英威达技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH