本发明专利技术涉及酶法制备手性3-羟基四氢呋喃的工艺及醇脱酶突变体，包括以下步骤：以3-酮基四氢呋喃为底物，该底物在醇脱氢酶突变体、辅因子以及辅因子再生体系在缓冲体系中发生生物催化反应生成手性3-羟基四氢呋喃；所述醇脱氢酶突变体所采用的醇脱氢酶，其野生基因序列来源于嗜热菌，碱基序列如SEQ ID No:1；该醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID No:2。本发明专利技术酶法制备手性3-羟基四氢呋喃的工艺，采用醇脱氢酶突变体制备手性3-羟基四氢呋喃的工艺，与化学法相比，具有环境污染小，效率高，光学选择性高等优点；与酶拆分法相比具有较高的纯度和转化率，ee值和转化率均可达到99%。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种制备手性3-羟基四氢呋喃的工艺，具体的说是酶法制备手性3-羟基四氢呋喃的工艺及醇脱氢酶突变体。
技术介绍
生物催化具有反应条件温和、效率高、立体和区域选择性强、环境友好等特点,因此生物催化在新药的研究和开发中得到了广泛的应用。此外,利用理性设计和定向进化对生物催化剂进行改造优化，如提高催化剂的稳定性和底物选择性,将使其能够更好地应用于生产工艺。醇脱氢酶（alcoholdehydrogenase,ADH）作为生物催化剂主要是用于合成手性醇（Catal.Sci.Technol.,2011,1,1311–1323）用于手性药物的合成。（S）-3-羟基四氢呋喃和（R）-3-羟基四氢呋喃在有机合成和药物生产中有着广泛的用途，结构式如(S)-2和(R)-2所示：，其中（S）-构型的主要用来合成HIV抑制剂安普那韦和膦沙那韦（Tetrahedron:Asymmetry2012,23,898-903）。目前（S）-或/和（R）-3-羟基四氢呋喃主要用化学法合成，如，用苹果酸和酒石酸为起始原料合成（S）-3-羟基四氢呋喃及其对映体（R）-3-羟基四氢呋喃（TheJournalofOrganicChemistry1983,48,2767-2769）。也有用酯酶对3-乙酸酯四氢呋喃通过动态拆分获得（S）-3-羟基四氢呋喃的报道（FEBSJournal2013,280,3084-3093.），但这种方法的转化率最高只有50%。
技术实现思路
本专利技术提供了一种酶法制备手性3-羟基四氢呋喃的工艺及醇脱氢酶突变体，该方法利用醇脱氢酶突变体制备手性3-羟基四氢呋喃的工艺，可以实现底物的全转化及高立体选择性。一种酶法制备手性3-羟基四氢呋喃的工艺，包括以下步骤：以3-酮基四氢呋喃为底物，该底物在醇脱氢酶突变体、辅因子以及辅因子再生体系在缓冲体系中发生生物催化反应生成手性3-羟基四氢呋喃；所述醇脱氢酶突变体为，I86V/W110L/L294Q、A85V/I86L/W110Q/L294Q、I86L/W110Q/L294Q/D307Y、I86L/W110Q/L294Q、A85V/I86L/L294Q、I86L/W110L/L294Q，I86V/L294H和I86L/W110S/L294Q；A85V/I86N/C295N、A85V/I86N/L294V/C295N、I86N/L294V/C295N、I86N/C295N、C295N、C295D、I86N、I86Q、L294Q/C295N、I86V/W110L/C295N、A85V/I86L/C295N、I86N/C295Q、I86N/C295I、I86N/C295G、I86N/C295H、I86N/C295P、I86N/C295D、I86N/C295M、I86N/C295E、I86N/C295S、I86N/L294V、I86A/L294N，A85V/I86L/W110S，I86Q/C295Q，I86N/C295A或/和I86Q/C295N；所述醇脱氢酶突变体所采用的醇脱氢酶，其野生基因序列来源于嗜热菌（Thermoethanolicusbrockii），碱基序列如SEQIDNo:1；该醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQIDNo:2。所述手性3-羟基四氢呋喃为（S）-3-羟基四氢呋喃（即S-3-羟基四氢呋喃）或（R）-3-羟基四氢呋喃（即R-3-羟基四氢呋喃）。酶法制备手性3-羟基四氢呋喃的工艺具体操作如下：①、配制反应体系：反应体系中包括，磷酸盐缓冲液，5~50mmol/L的3-酮基四氢呋喃作为底物和10%的异丙醇，醇脱氢酶突变体的粗酶液和0.01~0.1mmol/L的辅因子；②、将反应体系置于25～37℃的条件下进行反应，得到手性3-羟基四氢呋喃。用乙酸乙酯提取产物和底物并用GC检测反应过程，测定ee值及转化率。所述磷酸盐缓冲液的pH值为为7.0~8.0，浓度为50~100mmol/L。所述辅因子为NAD+或NADP+。所述辅因子以异丙醇为底物通过醇脱氢酶突变体的自催化进行再生。所述醇脱氢酶突变体也可以应用于催化杂环醇类化合物，该类杂环醇类化合物的结构式为或。有益效果是：本专利技术酶法制备手性3-羟基四氢呋喃的工艺，利用定向进化方法改造醇脱氢酶获得的醇脱氢酶突变体，采用醇脱氢酶突变体制备手性3-羟基四氢呋喃的工艺，与化学法相比，具有环境污染小，效率高，光学选择性高等优点；与酶拆分法相比具有较高的纯度和转化率，ee值和转化率均可达到99%。附图说明图1为突变体库A的引物设计与构建示意图；图2为突变体库B的引物设计与构建示意图。具体实施方式一种酶法制备手性3-羟基四氢呋喃的工艺，包括以下步骤：以3-酮基四氢呋喃为底物，该底物在醇脱氢酶突变体、辅因子以及辅因子再生体系在缓冲体系中发生生物催化反应生成手性3-羟基四氢呋喃；所述醇脱氢酶突变体为，I86V/W110L/L294Q、A85V/I86L/W110Q/L294Q、I86L/W110Q/L294Q/D307Y、I86L/W110Q/L294Q、A85V/I86L/L294Q、I86L/W110L/L294Q，I86V/L294H和I86L/W110S/L294Q；A85V/I86N/C295N、A85V/I86N/L294V/C295N、I86N/L294V/C295N、I86N/C295N、C295N、C295D、I86N、I86Q、L294Q/C295N、I86V/W110L/C295N、A85V/I86L/C295N、I86N/C295Q、I86N/C295I、I86N/C295G、I86N/C295H、I86N/C295P、I86N/C295D、I86N/C295M、I86N/C295E、I86N/C295S、I86N/L294V、I86A/L294N，A85V/I86L/W110S，I86Q/C295Q，I86N/C295A或/和I86Q/C295N；所述醇脱氢酶突变体所采用的醇脱氢酶，其野生基因序列来源于嗜热菌（Thermoethanolicusbrockii），碱基序列如SEQIDNo:1；该醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQIDNo:2。所述手性3-羟基四氢呋喃为（S）-3-羟基四氢呋喃或（R）-3-羟基四氢呋喃。其中所述的醇脱氢酶突变体，其中突变体I86V/W110L/L294Q、A85V/I86L/W110Q/L294Q、I86L/W110Q/L294Q/D307Y、I86L/W110Q/L294Q、A85V/I86L/L294Q、I86L/W110L/L294Q、I86V/L294H或I86L/W110S/L294Q等可以用于（S）-3-羟基四氢呋喃的酶法合成；醇脱氢酶突变体A85V/I86N/C295N、A85V/I86N/L294V/C295N、I86N/L294V/C295N、I86N/C295N、C295N、C295D、I86N、I86Q、L294Q/C295N本文档来自技高网...
【技术保护点】
醇脱氢酶突变体，其特征在于：所述醇脱氢酶突变体为，I86V/W110L/L294Q、A85V/I86L/W110Q/L294Q、I86L/W110Q/L294Q/D307Y、I86L/W110Q/L294Q、A85V/I86L/L294Q 、I86L/W110L/L294Q，I86V/L294H和I86L/W110S/L294Q；A85V/I86N/C295N、A85V/I86N/L294V/C295N、I86N/L294V/C295N、I86N/C295N、C295N、C295D 、I86N、I86Q、L294Q/C295N、I86V/W110L/C295N、A85V/I86L/C295N、I86N/C295Q、I86N/C295I、I86N/C295G、I86N/C295H、I86N/C295P、I86N/C295D、I86N/C295M、I86N/C295E、I86N/C295S、I86N/L294V、I86A/L294N，A85V/I86L/W110S，I86Q/C295Q，I86N/C295A或/和I86Q/C295N；所述醇脱氢酶突变体所采用的醇脱氢酶，其野生基因序列来源于嗜热菌（Thermoethanolicus brockii），碱基序列如SEQ ID No:1；该醇脱氢酶的氨基酸序列如 SEQ ID No:2。...
【技术特征摘要】
1.醇脱氢酶突变体，其特征在于：所述醇脱氢酶突变体为，I86V/W110L/L294Q、A85V/I86L/W110Q/L294Q、I86L/W110Q/L294Q/D307Y、I86L/W110Q/L294Q、A85V/I86L/L294Q、I86L/W110L/L294Q，I86V/L294H和I86L/W110S/L294Q；A85V/I86N/C295N、A85V/I86N/L294V/C295N、I86N/L294V/C295N、I86N/C295N、C295N、C295D、I86N、I86Q、L294Q/C295N、I86V/W110L/C295N、A85V/I86L/C295N、I86N/C295Q、I86N/C295I、I86N/C295G、I86N/C295H、I86N/C295P、I86N/C295D、I86N/C295M、I86N/C295E、I86N/C295S、I86N/L294V、I86A/L294N，A85V/I86L/W110S，I86Q/C295Q，I86N/C295A或/和I86Q/C295N；所述醇脱氢酶突变体所采用的醇脱氢酶，其野生基因序列来源于嗜热菌（Thermoethanolicusbrockii），碱基序列如SEQIDNo:1；该醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQIDNo:2。2.利用权利要求1所述醇脱氢酶突变体...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙周通，范文超，
申请(专利权)人：洛阳华荣生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41
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