多聚磷酸激酶突变体制造技术

本发明专利技术公开了一种多聚磷酸激酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3，该突变体的酶活力比野生酶提高了至少3倍，能够用于提升微生物再生ATP的能力。

【技术实现步骤摘要】
多聚磷酸激酶突变体
本专利技术属于酶工程
，具体地说，涉及一种多聚磷酸激酶突变体及其在提升微生物再生ATP能力方面的用途。
技术介绍
三磷酸腺苷(ATP)是生物体内最重要的高能磷酸化合物，临床上可用作治疗脑血管疾病、进行性肌萎缩、脑损伤、心机能不全、肾炎、心肌炎及肝炎等疾病的辅酶类药物。在生物催化的过程中，ATP作为生物合成中的能量货币，参与细胞内多酶催化，ATP作为能量供体推动反应的顺利进行，因此工业上常用来参与许多生物催化反应，用于高值化合物的合成。但是，ATP价格较高，限制了其在工业中的应用。开发可高效进行ATP循环再生的反应体系，是解决工业应用瓶颈的重要策略。其中，以无机多聚磷酸为磷酸供体，使用多聚磷酸激酶作为催化剂，可实现ADP或AMP生成ATP，ATP可进一步用于目标化学反应。因此，通过多聚磷酸酶(PPK)进行ATP再生的极具应用前景。众所周知，不同来源的PPK的酶催化特点各不相同。例如，专利文献CN108795958A报道了来源于大肠杆菌的PPK1(EcPPK)已应用于葡萄糖-6-磷酸的生产及低聚糖合成等；来源于苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)的PPK2(SmPPK2)可用于ADP的磷酸化形成ATP；来源于约氏不动杆菌(Acinetobacterjohnsonii)的PPK2(AjPPK2)和来源于节杆菌(Arthrobactersp.CGMCCNo.3584)的PPK可用于AMP的磷酸化形成ATP；来源于嗜热生物嗜热蓝细菌(Thermosynechococcuselongates)和嗜热菌(Thermusthermophilus)的重组PPK1被应用于耐高温的ATP依赖型反应中。但目前这些酶的催化效率普遍偏低，因此开发获得较高催化活力的酶具有重要经济性。专利技术人对于多种微生物来源的多聚磷酸激酶用于ATP循环再生系统进行了大量研究，例如在之前的专利文献CN111254129A中报道了一种源于谷氨酸棒杆菌(CorynebacteriumglutamicumATCC13032)来源的多聚磷酸激酶(PPK2)及其突变体，可作为ATP再生剂可促进谷胱甘肽合成酶催化法生产谷胱甘肽，但该突变体的酶活力仍达不到进行工业化大规模生产谷胱甘肽的要求。
技术实现思路
专利技术人在对于多种微生物来源的多聚磷酸激酶进行的研究中，还关注到约氏不动杆菌(Acinetobacterjohnsonii)来源的多聚磷酸激酶(GenBank登录号为AB092983.1，简写为ajPPK2或PPK2)即SEQIDNO:1的酶分子的分子量和氨基酸数量(475个)比其他来源的多聚磷酸激酶(氨基酸数量一般是300个左右)要大一些，根据生物信息学模拟的酶活性中心结构也与众不同，并且催化特点也与许多其他微生物来源的多聚磷酸激酶不同，能够有效地作为ATP再生剂催化AMP转化为ATP。为了进一步提高其酶活力，对其活性中心进行了研究和突变，并获得了酶活力明显提高的突变体。因此，本专利技术包括如下技术方案。一种多聚磷酸激酶突变体，其氨基酸序列为SEQIDNO:3，其为野生型多聚磷酸激酶(AjPPK2)的氨基酸序列SEQIDNO:1第177位的L(亮氨酸，Leu)替换为H(组氨酸，His)、第214位的F(苯丙氨酸，Phe)替换为P(脯氨酸，Pro)的突变体：MDTETIASAVLNEEQLSLDLIEAQYALMNTRDQSNAKSLVILVSGIELAGKGEAVKQLREWVDPRFLYVKADPPHLFNLKQPFWQPYTRFVPAEGQIMVWFGNWYGDLLATAMHASKPLDDTLFDEYVSNMRAFEQDLKNNNVDVLKVWFDLSWKSLQKRLDDMDPSEVHWHKLHGHDWRNKKQYDTLQKLRTRFTDDWQIIDGEDEDLRNHNPAQAILTALRHCPEHEKKAALKWQQAPIPDILTQFEVPQAEDANYKSELKKLTKQVADAMRCDDRKVVIAFEGMDAAGKGGAIKRIVKKLDPREYEIHTIAAPEKYELRRPYLWRFWSKLQSDDITIFDRTWYGRVLVERVEGFATEVEWQRAYAEINRFEKNLSSSQTVLIKFWLAIDKDEQAARFKARESTPHKRFKITEEDWRNRDKWDDYLKAAADMFAHTDTSYAPWYIISTNDKQQARIEVLRAILKQLKADRDTD(SEQIDNO:3)。根据本专利技术的第二个方面，提供了编码上述多聚磷酸激酶突变体的基因。优选地，当大肠杆菌作为宿主表达上述多聚磷酸激酶突变体时，编码多聚磷酸激酶突变体SEQIDNO:3的基因的核苷酸序列为SEQIDNO:4：ATGGATACCGAAACCATTGCGAGCGCGGTGCTGAACGAAGAACAGCTGAGCCTGGATCTGATTGAAGCGCAGTATGCGCTGATGAACACCCGCGATCAGAGCAACGCGAAAAGCCTGGTGATTCTGGTGAGCGGCATTGAACTGGCGGGCAAAGGTGAAGCGGTGAAACAGCTGCGCGAATGGGTGGATCCGCGCTTTCTGTATGTTAAGGCGGATCCGCCGCATCTGTTTAACCTGAAACAGCCGTTTTGGCAGCCGTATACCCGCTTTGTGCCGGCGGAAGGTCAGATTATGGTGTGGTTTGGCAACTGGTATGGCGATCTGCTGGCGACCGCGATGCATGCGAGCAAACCGCTGGATGATACCCTGTTTGATGAATATGTGAGCAACATGCGCGCGTTTGAACAAGATCTGAAAAACAATAACGTGGATGTGCTGAAAGTGTGGTTTGATCTGAGCTGGAAAAGCCTGCAGAAACGCCTGGATGATATGGATCCGAGCGAAGTGCATTGGCATAAACTGCATGGCCATGATTGGCGCAACAAAAAACAGTATGATACCCTGCAGAAACTGCGCACCCGCTTTACCGATGATTGGCAGATTATTGATGGCGAAGATGAAGATCTGCGCAACCATAACCCGGCGCAAGCGATTCTGACCGCGCTGCGCCATTGCCCGGAACATGAAAAAAAAGCGGCGCTGAAATGGCAGCAAGCGCCGATTCCGGATATTCTGACGCAGTTTGAAGTGCCGCAAGCGGAAGATGCGAACTATAAAAGCGAACTGAAAAAACTGACCAAACAAGTGGCGGATGCGATGCGCTGCGATGATCGCAAAGTGGTGATTGCGTTTGAAGGCATGGATGCGGCGGGCAAGGGTGGTGCCATTAAACGCATTGTGAAAAAACTGGATCCGCGCGAATATGAAATTCATACCATTGCGGCGCCGGAAAAATATGAACT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多聚磷酸激酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3。/n

【技术特征摘要】
1.一种多聚磷酸激酶突变体，其氨基酸序列为SEQIDNO:3。


2.编码如权利要求1所述多聚磷酸激酶突变体的基因。


3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，编码多聚磷酸激酶突变体SEQIDNO:3的基因的核苷酸序列为SEQIDNO:4。


4.包含如权利要求2或3所述基因的质粒。


5.如权利要求4所述的质粒，其特征在于，所述质粒选自下组的PET载体：pET22b、pET24a、pET28a。


6.表达如权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：范文超，高书良，丁鹏，
申请(专利权)人：洛阳华荣生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41