用于制备D-鸟氨酸的赖氨酸脱羧酶突变体制造技术

本发明专利技术公开了一种L‑赖氨酸脱羧酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6，能够有效催化L‑鸟氨酸的脱羧反应，从而通过外消旋鸟氨酸拆分法制备D‑鸟氨酸，具有工业化开发应用价值。

【技术实现步骤摘要】
用于制备D-鸟氨酸的赖氨酸脱羧酶突变体
本专利技术属于基因工程和酶催化
，具体地说，涉及一种L-赖氨酸脱羧酶(L-lysinedecarboxylase，Ldc)突变体、及其在制备D-鸟氨酸中的用途。
技术介绍
D-鸟氨酸是一种非天然氨基酸，具有独特的生物学特性，在多肽药物以及一些氨基酸类抗生素中杂入D-鸟氨酸后，新形成的药物因难以被细菌降解，可以降低细菌耐药性的产生。此外，D-鸟氨酸也可用于新型氨基酸农药的合成，应用前景广阔。已报道的D-鸟氨酸生产技术，一般是，以L-精氨酸为底物，经过水解和消旋反应得到DL-鸟氨酸混旋中间产物，然后使用蜂房哈夫尼菌(Hafniaalvei)AS1.1009中的赖氨酸脱羧酶进行拆分反应，获得D-鸟氨酸。目前也可以通过使用表达赖氨酸脱羧酶的大肠杆菌工程菌作为催化剂进行拆分反应，获得D-鸟氨酸。赖氨酸脱羧酶(EC4.1.1.18)，一般既可以催化L-赖氨酸发生脱羧反应，也可以催化L-鸟氨酸发生脱羧反应，其中L-鸟氨酸在L-赖氨酸脱羧酶(L-lysinedecarboxylase，Ldc)的催化下，生成腐胺和二氧化碳。
技术实现思路
专利技术人对于能够催化L-鸟氨酸脱酸的赖氨酸脱羧酶进行了广泛筛选，发现来源于反刍月形单胞菌(Selenomonasruminantium)的赖氨酸脱羧酶(UniProtKB-O50657)具有该功能，但酶活力偏低，难以进行工业化应用。于是尝试对其进行定向进化筛选，终于获得了酶活力明显提升的优良突变体，可以用于DL-鸟氨酸的拆分，实现D-鸟氨酸的制备。具体来说，本专利技术包括如下技术方案：一种L-赖氨酸脱羧酶突变体，其氨基酸序列为：SEQIDNO:4，其为SEQIDNO:1第136位的R替换为V、第64位的G替换为D、第207位的M替换为H的突变体，即：MKNFRLSEKEVKTLAKRIPTPFLVASLDKVEENYQFMRRHLPRAGVFYAMKANPTPEILSLLADLGSHFDVASAGEMEILHELGVDGSQMIYANPVKDARGLKAAADYNVRRFTFDDPSEIDKMAKAVPGADVLVVIAVRNNKALVDLNTKFGAPVEEALDLLKAAQDAGLHAMGICFHVGSQSLSTAAYEEALLVARRLFDEAEEHGMHLTDLDIGGGFPVPDAKGLNVDLAAMMEAINKQIDRLFPDTAVWTEPGRYMCGTAVNLVTSVIGTKTRGEQPWYILDEGIYGCFSGIMYDHWTYPLHCFGKGNKKPSTFGGPSCDGIDVLYRDFMAPELKIGDKVLVTEMGSYTSVSATRFNGFYLAPTIIFEDQPEYAARLTEDDDVKKKAAV(SEQIDNO:4)；SEQIDNO:6，其为SEQIDNO:1第136位的R替换为V、第67位的S替换为I、第241位的K替换为A、第310位的K替换为G的突变体，即：MKNFRLSEKEVKTLAKRIPTPFLVASLDKVEENYQFMRRHLPRAGVFYAMKANPTPEILSLLAGLGIHFDVASAGEMEILHELGVDGSQMIYANPVKDARGLKAAADYNVRRFTFDDPSEIDKMAKAVPGADVLVVIAVRNNKALVDLNTKFGAPVEEALDLLKAAQDAGLHAMGICFHVGSQSLSTAAYEEALLVARRLFDEAEEMGMHLTDLDIGGGFPVPDAKGLNVDLAAMMEAINAQIDRLFPDTAVWTEPGRYMCGTAVNLVTSVIGTKTRGEQPWYILDEGIYGCFSGIMYDHWTYPLHCFGGGNKKPSTFGGPSCDGIDVLYRDFMAPELKIGDKVLVTEMGSYTSVSATRFNGFYLAPTIIFEDQPEYAARLTEDDDVKKKAAV(SEQIDNO:6)。优选上述突变体的氨基酸序列为SEQIDNO:6。本专利技术的第二个目的在于提供编码上述L-赖氨酸脱羧酶突变体的基因。优选地，编码上述突变体SEQIDNO:4的基因具有下述核苷酸序列：atgaaaaatttcagacttagcgaaaaagaagtaaaaacgcttgccaagcgtatcccgacgccctttttggtggcttcactggacaaggttgaggaaaactaccagtttatgcgccgtcatttgccgcgggcgggagtgttttatgccatgaaggcgaatcctacgccagaaatactgtccctgctggctGATcttggttctcactttgatgtggcctctgccggggagatggagatcctccatgaattgggcgtagatggttcccagatgatatatgccaatccggtaaaggatgcccgtggcctcaaggctgcggctgactacaatgtccgccggtttactttcgacgatccgtcggaaatcgacaagatggccaaggctgtgccgggagccgatgtgctggtgGTGatcgccgtgcgcaacaacaaagctttggtggatctgaatacgaagtttggtgcgccggtggaagaagcgctggatcttttaaaggctgcgcaggatgctggcctgcatgccatggggatttgcttccatgtgggcagccagtccctgtctacggcggcttatgaggaagccctgctggtggctcgtaggctctttgatgaggcggaagaaCATggcatgcacctgactgacctcgacatcggcggcggtttccctgttcccgatgccaaggggctcaatgtggatctggcggccatgatggaagccatcaacaagcagatcgaccgcctgttcccggatacagctgtttggacggaaccgggccgttatatgtgcggtacggcggtgaacctcgtcacatcggttatcggcacgaaaacccgtggtgagcagccttggtatatcttagatgaaggcatctatggctgcttctccggcatcatgtatgaccactggacgtacccgcttcattgcttcggcaaggggaataagaaaccttcgactttcggcggccccagctgcgatggcatcgatgtgctctatcgcgacttcatggcaccggagctcaagatcggggacaaggtgctggtgacggaaatgggttcctataccagcgtcagcgctacgcgtttcaacggtttctacctggcgcccaccatcatctttgaggaccagccggaatatgcagcccgtctgacggaagatgatgatgtgaagaaaaaggcggctgtataa(SEQIDNO:3)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种L-赖氨酸脱羧酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6。/n

【技术特征摘要】
1.一种L-赖氨酸脱羧酶突变体，其氨基酸序列为SEQIDNO:4或SEQIDNO:6。


2.编码如权利要求1所述L-赖氨酸脱羧酶突变体的基因。


3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，编码L-赖氨酸脱羧酶突变体SEQIDNO:4的基因的核苷酸序列为SEQIDNO:3，编码L-赖氨酸脱羧酶突变体SEQIDNO:6的基因的核苷酸序列为SEQIDNO:5。


4.包含如权利要求3所述基因的质粒。


5.一种微生物，其表达如权利要求1所述的L-赖氨酸脱羧酶突变体。


6.如权利要求5所述的微生物，...

【专利技术属性】
技术研发人员：范文超，高书良，王金刚，丁鹏，
申请(专利权)人：洛阳华荣生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41