一种L-苹果酸脱氢酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种L‑苹果酸脱氢酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4，与野生型L‑苹果酸脱氢酶相比，显著提高了酶活力。该L‑苹果酸脱氢酶突变体能够通过酶促拆分DL‑苹果酸来生产高光学纯度的D‑苹果酸和草酰乙酸。

【技术实现步骤摘要】
一种L-苹果酸脱氢酶突变体及其应用
本专利技术属于酶催化
，具体地说，涉及一种L-苹果酸脱氢酶突变体、及其用于生产D-苹果酸和草酰乙酸的用途。
技术介绍
苹果酸，又名2-羟基丁二酸，由于分子中有一个不对称碳原子，故存在两种立体异构体L-苹果酸和D-苹果酸。天然存在的苹果酸都是L-型的，几乎存在于一切果实中，以仁果类中最多，也可由延胡索酸经生物发酵制得。它是人体内部循环的重要中间产物，易被人体吸收，因此作为性能优异的食品添加剂和功能性食品广泛应用于食品、化妆品、医疗和保健品等领域。DL-苹果酸可由延胡索酸或马来酸在催化剂作用下于高温高压条件和水蒸气作用制得。因为人体不易代谢D-苹果酸，因而不允许DL-苹果酸作为添加剂。随着医药工业的发展，D-苹果酸在医药工业中有越来越广泛的用途，例如，D-苹果酸作为手性前体可用于手性药物的合成，用作原料合成抗生素、抗病毒药物、抗组胺药物等。D-苹果酸的制备方法主要有化学合成法、外消旋体的物理和化学拆分法、生物法。化学合成及拆分法制备D-苹果酸成本较高，一直处于研究阶段。生物法制备D-苹果酸主要通过微生物自身诱导表达L-苹果酸脱氢酶的微生物由马来酸制备D-苹果酸；此外，参见CN110747190A，还有大肠杆菌表达L-苹果酸脱氢酶来全细胞催化制备D-苹果酸，产物浓度都可以达到200g/L以上，通过微生物自身诱导表达L-苹果酸脱氢酶的微生物培养条件复杂，微生物生长浓度不高，同时，产物中会含有少量的L-苹果酸、DL-苹果酸，苹果酸二聚体等难以分离的物质，提纯比较困难，造成工业化生产成本较高，无法满足市场需求。采用一种专一高效的L-苹果酸脱氢酶，以DL-苹果酸为底物，将其中的L-苹果酸脱氢转化成为草酰乙酸，然后分别纯化提起D-苹果酸和草酰乙酸，是一个可供选择的替代方法。
技术实现思路
为了探索酶促拆分法制备D-苹果酸的工业化可行性，我们将研究方向关注在L-苹果酸脱氢酶(MDH，EC1.1.1.37)的利用上，并对于各种来源的L-苹果酸脱氢酶进行了筛选和比较。L-苹果酸脱氢酶广泛存在于自然界的各种生物中，需要以NADP+(少数可以NAD+)为辅因子，可逆地催化L-苹果酸到草酰乙酸，是三羧酸循环(TCAcycle)的关键酶。源于冷海水黄杆菌(FlavobacteriumfrigidimarisKUC-1)的苹果酸脱氢酶(ffMDH)(SEQIDNO:1)可以特异地催化L-苹果酸的氧化和草酰乙酸的还原，并能同时以NAD+和NADP+作为辅因子，但ffMDH热稳定性较差，因此通过定向诱变获得高酶活性和立体选择性的突变酶是本专利技术的目标。经过高通量筛选和实验验证，最终获得一些酶活力显著提高的L-苹果酸脱氢酶突变体ffMDHmut，通过大肠杆菌过表达密码子优化的ffMDHmut基因和LreNox基因，再辅以NADH/NADPH氧化酶进行全细胞催化，可高效制备D-苹果酸和草酰乙酸，有望在工业化生产中得到应用。具体而言，本专利技术包含如下
技术实现思路
。一种L-苹果酸脱氢酶突变体，其氨基酸序列为：SEQIDNO:3，其为SEQIDNO:1第65位的Y替换为D、第139位的R替换为L、第231位的A替换为V的突变体，其氨基酸序列为：MKVTIVGAGNVGATCADVISYRGIASEVVLLDIKEGFAEGKALDIMQCATNTGFNTKVSGVTNDDSKTAGSDVVVITSGIPRKPGMTREELIGINAGIVKTVAENVLKHSPNTIIVVVSNPMDTMTYLALKATGVPKNLIIGMGGALDSSRFRTYLSLALDKPANDISAMVIGGHGDTTMIPLTRLASYNGIPVTEFLSEEVLQKVAADTMVGGATLTGLLGTSAWYAPGVSVAYLVDSILNDQKKMIACSVFVEGEYGQNDICIGVPCIIGKNGVEEILDIKLNDQEKALFAKSADAVRGMNDALKSILV(SEQIDNO:3)；或者SEQIDNO:4，其为SEQIDNO:1第65位的Y替换为C、第231位的A替换为R的突变体，其氨基酸序列为：MKVTIVGAGNVGATCADVISYRGIASEVVLLDIKEGFAEGKALDIMQCATNTGFNTKVSGVTNDCSKTAGSDVVVITSGIPRKPGMTREELIGINAGIVKTVAENVLKHSPNTIIVVVSNPMDTMTYLALKATGVPKNRIIGMGGALDSSRFRTYLSLALDKPANDISAMVIGGHGDTTMIPLTRLASYNGIPVTEFLSEEVLQKVAADTMVGGATLTGLLGTSAWYAPGRSVAYLVDSILNDQKKMIACSVFVEGEYGQNDICIGVPCIIGKNGVEEILDIKLNDQEKALFAKSADAVRGMNDALKSILV(SEQIDNO:4)。这两个突变体的共同特征是野生型L-苹果酸脱氢酶SEQIDNO:1第65位的酪氨酸Y(或Tyr)和第231位的丙氨酸A(或Ala)发生了突变。优选上述L-苹果酸脱氢酶突变体的氨基酸序列为SEQIDNO:3。本专利技术的第二个方面提供了一种编码上述L-苹果酸脱氢酶突变体SEQIDNO:3或者SEQIDNO:4的基因。优选地，编码上述L-苹果酸脱氢酶突变体SEQIDNO:3的基因可以是核苷酸序列SEQIDNO:5。本专利技术的第三个方面提供了一种质粒，其包含编码上述L-苹果酸脱氢酶突变体的基因。该质粒优选是pET系列载体，比如是pET28a、pET24a或者pET-Duet，但并不受限于此。在一种实施方式中，上述质粒还可以包含NADH氧化酶基因(Nox基因)，使得该质粒能够共表达L-苹果酸脱氢酶突变体的基因和NADH氧化酶的基因。优选该质粒载体是pET-Duet，由于pET-Duet含有双T7启动子，可同时启动两个基因比如L-苹果酸脱氢酶突变体基因和Nox基因的表达。优选地，所述Nox基因是罗伊氏乳杆菌(LactobacillusreuteriJCM1112)来源的Nox基因(GenBank:AP007281.1)，简称为LreNox基因，SEQIDNO:6：atgaaggttattattgttggttgtacacatgcgggaacaattactgccactcaaattttacagaatcatccagaaacagaagtcacaatttatgaacggaatgataacgtttcattcctctcatgtgggattgcagtttacttgagcggtgatgttggtaatccagatgcgatgttttattcaagccctgaacaacttgctgccatgggtgcaacagttcatatgcaacataatgtaactgatattgaccctaagactaagacagtcacagtgacagaccttgtgacaggcgaaacaaagaccgaccattatgataagttagttgatac本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种L-苹果酸脱氢酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3或者SEQ ID NO:4。/n

【技术特征摘要】
1.一种L-苹果酸脱氢酶突变体，其氨基酸序列为SEQIDNO:3或者SEQIDNO:4。


2.编码如权利要求1所述L-苹果酸脱氢酶突变体的基因。


3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，编码L-苹果酸脱氢酶突变体SEQIDNO:3的基因核苷酸序列为SEQIDNO:5。


4.一种质粒，其特征在于，包含如权利要求3所述的基因。


5.如权利要求5所述的质粒，其特征在于，还包含NADH氧化酶基因即Nox基因。


6.转化了如权利要求4或5...

【专利技术属性】
技术研发人员：范文超，高书良，丁鹏，
申请(专利权)人：洛阳华荣生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41