羰基还原酶突变体及在制备手性β’-羟基-β-氨基酸酯中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种羰基还原酶突变体及其在（2

【技术实现步骤摘要】
羰基还原酶突变体及在制备手性β’-羟基-β-氨基酸酯中的应用
本专利技术涉及酶工程和生物
，具体涉及羰基还原酶突变体及其在制备手性β’-羟基-β-氨基酸酯及结构类似物中的应用。
技术介绍
碳青霉烯类抗生素是当前临床应用的抗生素中具有最广泛的抗菌谱和最高的抗菌活性的一类β-内酰胺类抗生素，且不存在与其他β-内酰胺类抗生素之间的交互耐药性，可以用来治疗对其他抗生素有耐药性的菌种。碳青霉烯类抗生素结构通式手性β’-羟基-β-氨基酸酯是合成碳青霉烯类抗生素的关键中间体。目前文献中报道较多的是利用金属配合物（Dynamickineticresolutionofβ-keto-β-aminoestersusingRu-DTBM-Sunphoscatalyzedasymmetrichydrogenation,Tetrahedron,2013,69,7152-7156;NewChiralDiphosphineLigandsDesignedtoHaveaNarrowDihedralAngleintheBiarylBackbone,Adv.Synth.Catal.2001,343,264-267）实现动态动力学拆分获得（2S,3R）-3-羟基-2-（保护的胺）甲基丁酸酯，但是金属配合物的催化往往需要比较苛刻的反应条件，金属的配体需要多步的合成步骤。羰基还原酶可以实现羰基的立体选择性还原，在制备手性醇方面应用广泛，通过对羰基还原酶的改造可以实现提高酶活力和立体选择性，底物的氨基被苯甲酰基保护，野生型或改造后的羰基还原酶实现其还原（醛酮还原酶及其在合成（2S,3R）-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯中的应用，CN201410706195.1；Ketoreductasepolypeptidesfortheproductionofazetidinone,US20170002333），但是由于苯甲酰基脱保护时在水溶液中可能会被部分水解。使用邻苯二甲酰基保护氨基时可以使氨基在特定条件下水解脱除保护，但是使用生物法在转化β’-羰基-β-氨基酸酯时的效果较差，不仅底物浓度低，而且获得的还原产物是混合物（StereoselectiveProstereogenic3-OxoEsterReductionMediatedbyaNovelYeastAlcoholDehydrogenaseDerivedfromKluyveromycesmarxianusCBS6556,Adv.Synth.Catal.2007,349,1111–1118）。为了实现β’-羰基-β-（邻苯二甲酰亚胺）甲基酸酯的动态动力学的还原对碳青霉烯类抗生素的合成研究和工业应用具有重要意义。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种通过基因工程手段改造后的羰基还原酶突变体，具体地，改造后的羰基还原酶突变体合成手性（2S,3R）-3-羟基-2-（邻苯二甲酰亚胺）甲基丁酸酯的活力和立体选择性显著提高。首先，本专利技术提供一种羰基还原酶突变体，所述的羰基还原酶突变蛋白与SEQIDNO.:1所示的氨基酸序列具有至少90%同一性，且所述突变蛋白具有合成手性（2S,3R）-3-羟基-2-（邻苯二甲酰亚胺）甲基-丁酸甲酯的能力，并且催化活性和立体选择性显著提高。优选地，本专利技术提供的羰基还原酶突变体是：在对应于SEQIDNO.1的氨基酸序列的第1至342位中仅存在第207，224，226，242，245在内的一个或多个位点突变。更具体地，本专利技术提供的羰基还原酶突变体是：在对应于SEQIDNO.1的氨基酸序列的第1至342位中仅存在下述突变：S134I且T135I；T135R且S224A；Y208I且S224A；M242A且Q245S；M242V且Q245L；M242F且Q245T；M242V且Q245S；P243F且Q245G；S224A、M242V且Q245S；M242V、Q245S且W226I。更优选地，M242F且Q245T；M242V且Q245S；P243F且Q245G；S224A、M242V且Q245S；M242V、Q245S且W226I，其氨基酸序列为SEQIDNO.3-7之一所示。本专利技术还提供上述突变体的编码基因。进一步提供含所述基因的表达载体、重组细胞。本专利技术还提供本专利技术的羰基还原酶突变体或其编码基因在制备手性（2S,3R）-3-羟基-2-（邻苯二甲酰亚胺）甲基丁酸甲酯化合物中的应用。在具体实施方式中，所述应用是以下式的β’-羰基-β-（保护）氨基酸酯化合物作为底物：，更优选地底物为β’-羰基-β-（邻苯二甲酰亚胺）甲基丁酸甲酯。具体地，将本专利技术所述的羰基还原酶突变体与反应底物接触，进行催化反应，从而获得所述（2S,3R）-3-羟基-2-（邻苯二甲酰亚胺）甲基丁酸甲酯化合物；任选地，还包括分离并纯化所述（2S,3R）-3-羟基-2-（邻苯二甲酰亚胺）甲基丁酸甲酯化合物的步骤。在一个具体实施方式中，所述催化反应以表达所述羰基还原酶突变体的编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以β’-羰基-β-（邻苯二甲酰亚胺）甲基丁酸甲酯化合物为底物，以pH为6.0-11.0的缓冲液作为反应介质，在25℃-50℃条件下进行反应。在更优选的实施方式中，所述反应中，反应体系中的催化底物浓度为50-250g/L，更佳地，底物浓度为100-150g/L；反应体系含有菌体量为10-150g/L，更佳地，30-100g/L；反应体系的pH为6.0-9.0，最佳为7.0；反应温度为25℃-35℃，最佳为30℃。具体的反应体中加入NADP+，葡萄糖，葡萄糖脱氢酶，且在150rpm-250rpm的条件下反应，反应时间为5-25小时。更优选地，加入0.2g/LNADP+，2.5倍当量葡萄糖，2g/L葡萄糖脱氢酶冻干酶粉，于30℃，200rpm的摇床上反应，反应10h。在另外的优选方式中，反应体系还添加有助溶剂，更具体地助溶剂为乙腈、丙酮、甲醇、乙醇、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、1,4-二氧六环，较佳地，无助溶剂、甲醇、乙醇、二甲基亚砜。本专利技术的羰基还原酶突变体，催化获得的（2S,3R）-3-羟基-2-（邻苯二甲酰亚胺）甲基-丁酸甲酯的转化率≥70%，较佳地，≥90%，更佳地，≥97%；远高于野生型的羰基还原酶的转化率；催化获得的（2S,3R）-3-羟基-2-（邻苯二甲酰亚胺）甲基-丁酸甲酯ee值≥80%，较佳地，≥90%，更佳地，≥99%，de值≥80%，较佳地，≥90%，更佳地，≥98%；也远远优于野生型的羰基还原酶的转化率。附图说明图1β’-羰基-β-（邻苯二甲酰亚胺）甲基丁酸甲酯的还原后消旋体混合物的液相谱图。其中，保留时间分别为39.5min,43.4min,60.6min,62.6min，对应的结构式如下：。图2突变体12转化粗品的液相谱图。具体实施方式下面通过具体实施方式对本专利技术作进一本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.羰基还原酶突变体，其特征在于，在对应于SEQ ID NO.:1的氨基酸序列的第1至342位中仅存在下述之一的突变：S134I且T135I；T135R且S224A；Y208I且S224A；M242A且Q245S；M242V且Q245L；M242F且Q245T；M242V且Q245S；P243F且Q245G；S224A、M242V且Q245S；M242V、Q245S且W226I。/n

【技术特征摘要】
1.羰基还原酶突变体，其特征在于，在对应于SEQIDNO.:1的氨基酸序列的第1至342位中仅存在下述之一的突变：S134I且T135I；T135R且S224A；Y208I且S224A；M242A且Q245S；M242V且Q245L；M242F且Q245T；M242V且Q245S；P243F且Q245G；S224A、M242V且Q245S；M242V、Q245S且W226I。


2.如权利要求1所述的羰基还原酶突变体，其特征在于，在对应于SEQIDNO.:1的氨基酸序列的第1至342位中仅存在下述之一的突变：M242F且Q245T；M242V且Q245S；P243F且Q245G；S224A、M242V且Q245S；M242V、Q245S且W226I。


3.如权利要求1或2所述的羰基还原酶突变体的编码基因。


4.含有如权利要求1或2所述的羰基还原酶突变体的编码基因的表达载体。


5.含有如权利要求1或2所述的羰基还原酶突变体的编码基因的重组细胞。


6.如权利要求1或2所述的羰基还原酶突变体在制备手性（2S,3R）-3-羟基-2-（邻苯二甲酰亚胺）甲基丁酸甲酯化合物中的应用。


7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用是以下式...

【专利技术属性】
技术研发人员：马延和，刘祥涛，张红榴，陈曦，姚培圆，冯进辉，吴洽庆，朱敦明，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12