本发明专利技术提供了一种羰基还原酶突变体及其在S‑3‑环戊基‑3‑羟基丙腈合成中的应用，具体地，本发明专利技术提供了一种提高催化合成S‑3‑环戊基‑3‑羟基丙腈立体选择性的羰基还原酶突变体，所述的突变蛋白为非天然蛋白，且所述突变蛋白具有显著提高催化3‑环戊基‑3‑氧代丙腈生成S‑3‑环戊基‑3‑羟基丙腈立体选择性的特点，并且所述突变蛋白在野生型的羰基还原酶的一个或一个以上的与酶催化活性相关的核心氨基酸发生突变。本发明专利技术的羰基还原酶突变体可以显著提高产物的光学纯度。
【技术实现步骤摘要】
羰基还原酶突变体及其应用
本专利技术属于生物工程领域，具体地，本专利技术涉及羰基还原酶突变体及其在制备手性β-羟基腈的中的应用。
技术介绍
手性β-羟基腈是合成许多天然产物和生物活性物质的关键中间体，虽然化学不对称合成方法近年来获得了很大进展，可以通过不对称的催化氢化还原反应(一种鲁索替尼中间体的合成方法王永、刘利刚、项杰、杨世琼、李倩、康立涛，CN104496904A)，氧杂Micheal加成反应(Oxa-MichaelAdditiontoα,β-UnsaturatedNitriles:AnExpedientRoutetoγ-AminoAlcoholsandDerivativesGuoBeibei,ZijlstraDouweS.,deVriesJohannes,OttenEdwinChemCatChem2018,10,2868–2872)，酶法拆分(DramaticEnhancementofEnantioselectivityofBiotransformationsofβ-HydroxyNitrilesUsingaSimpleO-BenzylProtection/DockingGroupMaDa-You,ZhengQi-Yu,WangDe-Xian,WangMei-XiangOrganicLetters2006,8,3231-3234)等方法实现手性β-羟基酸衍生物的合成，但是利用生物体系和酶体系催化的不对称合成方法以其条件温和、环境友好、高化学和立体选择性和操作简便等优点而更为引人注目。生物催化的β-羟基酸衍生物的动力学拆分、去对称化、去消旋化及α-羰基腈还原等都能有效地实现手性β-羟基腈的合成。
技术实现思路
为了在温和的反应条件下合成手性的β-羟基腈，本专利技术以α-羰基腈为底物，使用羰基还原酶及其突变体作为催化剂，对羰基进行还原从而制备高手性纯度的β-羟基腈。本专利技术的有益效果：通过对羰基还原酶的改造，大大提高其对α-羰基腈的立体选择性，高纯度的合成S-β-羟基腈。具体实施方式下面的实施例进一步说明本专利技术的内容，但不应理解为对本专利技术的限制。本专利技术第一方面提供一种合成高手性纯度的β-羟基腈的方法，利用工程化改造后的羰基还原酶作为催化剂，改造后的羰基还原酶与SEQIDNO.1具有至少90％同一性，且所述的突变体转化产物S-β-羟基腈的ee值>98％。另一方面提供的羰基还原酶突变蛋白，所述的突变蛋白为非天然蛋白，且所述突变蛋白是在对应于SEQIDNO.1:1-249中的位点93,138,139,和144在内的一个或多个位点突变的羰基还原酶突变体：在另一优选例中，所述的第93位组氨酸(H)突变为苯丙氨酸(F)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)，优选苯丙氨酸(F)。在另一优选例中，所述的第138位缬氨酸突变为苯丙氨酸(F)、天冬酰胺(N)，优选苯丙氨酸(F)。在另一优选例中，第139位丙氨酸(A)突变为缬氨酸(V)、亮氨酸(L)和异亮氨酸(I)，优选缬氨酸(V)。在另一优选例中，第144位亮氨酸(L)突变为苯丙氨酸(F)、天冬酰胺(N)，优选苯丙氨酸(F)。在另一优选例中，羰基腈底物为3-环戊基-3-氧代丙腈。在另一优选例中，所述的羰基还原酶的突变体催化如下反应：具体地，所述催化反应以含羰基还原酶突变体编码基因和葡萄糖脱氢酶/加酸脱氢酶编码基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以3-环戊基-3-氧代丙腈为底物，加入一定量的葡萄糖/甲酸钠，以pH为6.0-10.0的缓冲液为反应介质，在25℃-50℃、搅拌条件下进行还原反应；所述反应具有选自下组的一个或多个特点：(i)反应体系含有菌体量为10-100g/L，更佳地，10-30g/L；(ii)反应体系的pH为6.0-10.0，较佳地，6-8，更佳地，6.5；(iii)反应体系温度为25℃-50℃，较佳地，25℃-35℃，更佳地，30℃。(iv)反应体系助溶剂为无助溶剂，乙腈、丙酮、甲醇、乙醇、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、二氯甲烷、1,4-二氧己环，较佳地，无助溶剂、甲醇、乙醇、N，N-二甲基甲酰胺、丙酮，更佳地，甲醇。(v)催化底物浓度为10-200g/L，更佳地，底物浓度为30-180g/L；(vi)催化获得的S-β-羟基腈的ee值≥90％，较佳地≥95％，更佳地≥99.0％。本专利技术第三方面提供了一种羰基还原酶突变体在制备S-β-羟基腈化合物的应用，包括步骤：(i)将本专利技术第二方面所述的突变体与反应底物接触，进行催化反应，从而获得S-β-羟基腈；和(ii)任选地，分离并纯化所述S-β-羟基腈化合物。附图说明图1显示了BuADH与突变体蛋白经诱导表达后结果。其中，M表示Marker，1为BuADH可溶蛋白表达，2为BuADH不可溶蛋白表达，3、5、7为代表性突变体可溶蛋白表达，4、6、8为代表性突变体不可溶蛋白表达。图2产物3-环戊基-3-羟基丙腈消旋体。图3S-3-环戊基-3-羟基丙腈。具体实施方式术语如本文所用，术语“表示第xx位的氨基酸A变为氨基酸B，例如H93F表示第93位的氨基酸H突变为F，以此类推。在本专利技术的一优选实施方式中，本专利技术的羰基还原酶突变体的制备方法如下：大肠杆菌作为表达宿主。具体地，该制备方法包括以下步骤：(1)羰基还原酶BuADH相应突变位点的基因构建到pET21a表达载体上，获得带有目的酶基因的重组质粒。(2)将重组质粒转入宿主菌细胞优选大肠杆菌BL21(DE3)，获得相应的工程菌株。(3)将工程菌株接种至LB培养基中，37℃培养3小时，加入0.1mM的异丙基硫代半乳糖苷25℃培养12小时。(4)离心收集菌体。实施例1羰基还原酶BuADH突变体库的构建根据已知羰基还原酶结构，模拟BuADH的结构，选择其底物结合口袋内非保守残基分别进行饱和突变，采用简并密码子NNK设计突变引物，以pET21a-BuADH作为模板。将所得到的单克隆菌落挑取到96孔深孔板中进行培养，对表达的蛋白进行高通量活力筛选，筛选方法为检测340nm处NADPH的下降。建库突变的位点分别为93，137，138，139，144，205，获得立体选择性提高的有益突变位点93,138,139和144，分别为突变体1、2、3、4，蛋白序列如SEQIDNO.:2-5所示。对3-环戊基-3-氧代丙腈转化实验测定，结果表明单点突变中突变体3活力最好，且立体选择性有明显提高，蛋白序列如SEQIDNO.:4所示。实施例2羰基还原酶BuADH组合突变体库构建根据饱和突变结果，选取活力提高，立体选择性最优突变体为模板，分别构建组合突变体库。对3-环戊基-3-氧代丙腈转化实验测定，结果表明单点突变中两位点组合突变获得的突变体为突变体5和6，蛋白序列为SEQIDNO.:6和7，以本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种羰基还原酶，其特征在于，所述序列为SEQ ID NO：1，具有还原羰基化合物的功能。/n
【技术特征摘要】
1.一种羰基还原酶，其特征在于，所述序列为SEQIDNO：1，具有还原羰基化合物的功能。
2.羰基还原酶的突变体蛋白序列，其特征在于，所述突变体蛋白序列与SEQIDNO：1具有至少90％同一性，且所述突变体具有高立体选择性还原α-羰基腈的活性。
3.权利要求2的突变体，所述的位点对应于SEQIDNO：1的氨基酸1至249中的位点93、138、139、144突变获得的突变体。
4.权利要求3的突变体，其包括在对应于SEQIDNO：1上的以下任一种位点的突变：
在93位上的突变；
在138位上的突变；
在139位上的突变；
在144位上的突变。
5.权利要求4的突变体，其特征在于，对应于SEQIDNO：1上的第93位组氨酸(H)突变为苯丙氨酸(F)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)，优选苯丙氨酸(F)；对应于SEQIDNO：1上的第138位缬氨酸突变为苯丙氨酸(F)、天冬酰胺(N)，优选苯丙氨酸(F)；对应于SEQIDNO：1上的第139位丙氨酸(A)突变为缬氨酸(V)、亮氨酸(L)和异亮氨酸(I)，优选缬氨酸(V)；对应于SEQIDNO：1上的第144位亮氨酸(L)突变为苯丙氨酸(F)、天冬酰胺(N)，优选苯丙氨酸(F)。
6.权利要求3的突变体，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：崔云凤，陈曦，张红榴，朱良彦，冯进辉，吴洽庆，朱敦明，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12
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