羰基还原酶突变体及其在催化合成17β-羟基甾体化合物中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种羰基还原酶突变体及其在催化合成17β‑羟基甾体化合物中的应用，所述突变体在野生型的羰基还原酶的一个核心氨基酸发生突变。本发明专利技术提供的这些突变体能够显著提高羰基还原酶转化一系列17‑羰基甾体化合物的能力，并且具有高的立体选择性。本发明专利技术提供的重组细胞作为生物催化剂，能以高底物投料浓度，获得高收率的目标产物，副产物少，产率不低于95％，而且转化时间短，所用生物催化剂用量少，时空产率远高于目前报道水平，制备方法简单方便、条件温和、环境友好。

【技术实现步骤摘要】
羰基还原酶突变体及其在催化合成17β-羟基甾体化合物中的应用
本专利技术涉及酶及酶工程领域，具体地，本专利技术涉及羰基还原酶突变体在催化17-羰基甾体化合物合成17β-羟基甾体化合物中的应用。
技术介绍
甾体药物具有很强的抗感染、抗过敏、抗病毒和抗休克等药理作用。随着时代的不断发展，甾体药物已经成为仅次于抗生素的第二大类药物。甾体激素类药物分类：肾上腺皮质激素，包括氢化可的松，强的松等，可治疗阿狄森氏症，抗炎，抗过敏，抗休克的等；蛋白同化激素，其主要生理功能是抑制蛋白异化和促进蛋白合成，主要用于治疗蛋白质增加和合成不足引起的疾病；性激素，包括雌性激素、雄性激素和孕激素。17β-羟基甾体化合物作为药物及药物中间体具有重要的药用价值和工业应用潜力。如睾酮(TS)是一类重要的甾体激素药物，临床上作为性激素药物治疗原发性和继发性男性性腺功能减退，维持男性第二特征、性功能等。其庚酸酯、丙酸酯及其半合成产物甲基睾丸素、苯丙酸诺龙等也是临床药物，它具有维持肌肉强度及质量、维持骨质密度及强度、提神及提升体能等作用。传统工业上17β-羟基甾体化合物的合成是通过一系列化学方法从甾醇或者17-羰基甾体化合物制得，虽最终能获得产物，但产品纯度低，副产物的生成增加了纯化难度，而且存在环境污染问题。采用生物催化技术，可以一步将17-羰基甾体化合物转化为17β-羟基甾体化合物，反应步骤简单，且具有高的立体选择性和区域选择性，具有广阔的应用前景。自二十世纪30年代以来，研究学者已经开始利用不同微生物转化17-羰基甾体化合物来实现17β-羟基甾体化合物的合成，但存在转化效率低、副产物多等问题。17β-羟基甾体脱氢酶为性激素合成过程中最后步骤的催化酶，它能催化甾体化合物C17位上的羰基和羟基之间的还原和氧化反应，有研究学者利用该类酶作为生物催化剂来转化17-羰基甾体化合物合成17β-羟基甾体化合物(MinglongShao,XianZhang,ZhimingRao,etal.GreenChemistry,2016(18):1774-1784)，然而转化效率不高，所需的菌体量大，转化的底物浓度低。因此开发活力更高的生物催化剂，并应用于一步将17-羰基甾体化合物转化为17β-羟基甾体化合物，仍是今后研究的热点。
技术实现思路
针对现有技术的不足及实际的需求，本专利技术提供了一种羰基还原酶突变体，提高了其转化效率，有利于其在催化合成17β-羟基甾体化合物中的应用。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供了一种羰基还原酶的突变体，其氨基酸序列与野生型羰基还原酶氨基酸序列SEQIDNO：1具有至少90％同一性，且所述的突变体具有转化17-羰基甾体化合物生成17β-羟基甾体化合物的能力。优选地，所述野生型羰基还原酶来源于Ralstoniasp.DSM6428。本专利技术中，专利技术人通过设计205位氨基酸的突变，发现该位点的突变会提高羰基还原酶转化17-羰基甾体化合物的能力，并且具有高的立体选择性。所述第205位氨基酸从苯丙氨酸(F)突变为丙氨酸(A)、精氨酸(R)、赖氨酸(K)，异亮氨酸(I)、组氨酸(H)、亮氨酸(L)、色氨酸(W)、甲硫氨酸(M)、脯氨酸(P)、半胱氨酸(C)、缬氨酸(V)、甘氨酸(G)、丝氨酸(S)、谷氨酰胺(Q)、酪氨酸(Y)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)，优选丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、半胱氨酸(C)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、苏氨酸(T)、丝氨酸(S)、甘氨酸(G)，更优选丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、异亮氨酸(I)、甘氨酸(G)。第二方面，本专利技术提供了一种多核苷酸，所述的多核苷酸编码本专利技术第一方面所述的突变体。第三方面，本专利技术提供了一种重组细胞，所述重组细胞表达了第一方面所述的突变体，还表达了能够催化NADP+合成NADPH的葡萄糖脱氢酶(GDH)。第四方面，本方面提供了一种制备17β-羟基甾体化合物的方法，将本专利技术第三方面所述的重组细胞与反应底物接触，进行催化反应，从而获得17β-羟基甾体化合物。在另一优选例中，所述反应底物包括雄甾-4-烯-3,17-二酮，9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮，雄甾-4-烯-3,11,17-三酮，雄甾-4,9(11)-二烯-3,17-二酮，19-去甲雄甾-4-烯-3,17-二酮，雌甾-4,9-二烯-3,17-二酮，19-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮，3β-羟基-5-雄烯-17-酮，雌酚酮，雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮，表雄酮。在另一优选例中，所述反应具有选自下组的一个或多个特点：(i)反应体系的pH为5.0-9.0，较佳地，5.0-8.0，更佳地，7.0；(ii)反应体系助溶剂为无助溶剂，乙腈、丙酮、甲醇、乙醇、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、二氯甲烷、1,4-二氧己环，较佳地，无助溶剂、甲醇、乙醇、N，N-二甲基甲酰胺、异丙醇，更佳地，甲醇、乙醇、异丙醇。(iii)所述催化反应的温度为20-60℃，较佳地，25-50℃，更佳地，25-32℃。(iiii)反应时间为1-24小时，较佳地，5-12小时。应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：(i)本专利技术提供了多种羰基还原酶突变体，能够显著提高羰基还原酶转化一系列17-羰基甾体化合物的能力，并且具有高的立体选择性。(ii)本专利技术提供的重组细胞作为生物催化剂，能以高底物投料浓度，获得高收率的目标产物，副产物少，产率不低于95％，而且转化时间短，所用生物催化剂用量少，时空产率远高于目前报道水平，制备方法简单方便、条件温和、环境友好。附图说明图1所示的是17β-羟基-雄甾-4-烯-3-酮标样的HPLC图；图2所示是实施例4,5,6,7中转化雄甾-4-烯-3,17-二酮得到的产品HPLC图，17β-羟基-雄甾-4-烯-3-酮的保留时间为7.618min，雄甾-4-烯-3,17-二酮的保留时间为14.161min；图3所示的是17β-羟基-19-去甲雄甾-4-烯-3,17-二酮标样的HPLC图；图4所示的是实施例4,5,6,7中转化19-去甲雄甾-4-烯-3,17-二酮得到的产品HPLC图，17β-羟基-19-去甲雄甾-4-烯-3,17-二酮的保留时间为8.089min，19-去甲雄甾-4-烯-3,17-二酮的保留时间为15.039min；图5所示的是17β-羟基-雌甾-4,9-二烯-3-酮标样的HPLC图；图6所示的是实施例4,5,6,7中转化雌甾-4,9-二烯-3,17-二酮得到的产品HPLC图，17β-羟基-雌甾-4,9-二烯-3-酮的保留时间为10.653min，雌甾-4,9-二烯-3,17-二酮的保留时间为2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种羰基还原酶的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列与野生型羰基还原酶氨基酸序列SEQ ID NO：1具有至少90％同一性，且所述的突变体具有转化17-羰基甾体化合物生成17β-羟基甾体化合物的能力。/n

【技术特征摘要】
1.一种羰基还原酶的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列与野生型羰基还原酶氨基酸序列SEQIDNO：1具有至少90％同一性，且所述的突变体具有转化17-羰基甾体化合物生成17β-羟基甾体化合物的能力。


2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述野生型羰基还原酶(RasADH)来源于Ralstoniasp.DSM6428。


3.根据权利要求1或2所述的突变体，其特征在于，包括在一个位点上的突变，所述的位点对应于SEQIDNO：1的氨基酸1至249中的位点205。


4.根据权利要求3所述的突变体，其特征在于，对应于SEQIDNO：1上的位点205的氨基酸由苯丙氨酸(F)突变为丙氨酸(A)、精氨酸(R)、赖氨酸(K)，异亮氨酸(I)、组氨酸(H)、亮氨酸(L)、色氨酸(W)、甲硫氨酸(M)、脯氨酸(P)、半胱氨酸(C)、缬氨酸(V)、甘氨酸(G)、丝氨酸(S)、谷氨酰胺(Q)、酪氨酸(Y)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)，优选丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、半胱氨酸(C)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、苏氨酸(T)、丝氨酸(S)、甘...

【专利技术属性】
技术研发人员：王玉，陈曦，张红榴，刘祥涛，冯进辉，吴洽庆，朱敦明，马延和，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12