龙脑樟冰片脱氢酶CcBDH3及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种龙脑樟冰片脱氢酶CcBDH3基因及其编码产物与应用。本发明专利技术从龙脑樟叶片中克隆得到Ccbdh3基因，该基因是首次从龙脑樟中得到的单萜类成分合成的关键酶基因。通过实验证明：本发明专利技术的CcBDH3蛋白能够催化右旋龙脑((+)‑borneol)形成右旋樟脑((+)‑camphor)，能够催化左旋龙脑((‑)‑borneol)形成左旋樟脑((‑)‑camphor)不仅对龙脑樟中的樟脑等单萜类化合物的生物合成具有重要作用，也对于调节和生产植物单萜类化合物具有重要的理论及实际意义。

【技术实现步骤摘要】
龙脑樟冰片脱氢酶CcBDH3及其编码基因与应用
本专利技术涉及药用植物基因工程领域，具体涉及龙脑樟冰片脱氢酶CcBDH3基因及其编码产物与应用。
技术介绍
樟树(Cinnamomumcamphora(L.)presl)为樟科樟属常绿乔木树种，国家Ⅱ级保护植物，是一种集材用、药用、香精香料、油用、风景园林等多用途的经济植物，具有巨大的开发利用价值。樟树有至少5个化学类型，即龙脑型、樟脑型、1.8-桉叶油型、芳樟醇型、异橙花叔醇型等。其中樟脑型—脑樟(Cinnamomumcamphorachvar.Camphor)富含樟脑化合物(camphor)。天然樟脑是我国重要的特产之一，也是我国出口的传统商品。明代李时珍著《本草纲目》中记载：“樟脑出韶州、漳州，状似龙脑，色白如雪，樟树脂膏也。”天然樟脑用于制造赛璐珞和摄影胶片；无烟火药制造中用作稳定剂；医药方面用于制备中枢神经兴奋剂(如十滴水、人丹)和复方樟脑酊等。能防虫、防腐、除臭，具馨香气息，是衣物、书籍、标本、档案的防护珍品。天然樟脑纯度高、比旋度大，在医药等方面的特殊用途难于用合成樟脑完全代替。主要分布在我国的台湾、福建、江西、广东、广西、湖南、湖北、浙江、四川、云南和贵州等省区。另外，樟树植物生长缓慢，再加上这些有效成分在植物体中的含量不多，因而大大限制了它的发展。樟脑(camphor)，根据旋光性不同可分为右旋樟脑((+)-camphor)，左旋樟脑((-)-camphor)，IUPAC名称1,7,7-三甲基二环[2.2.1]庚烷-2-酮，是一种萜类有机化合物，室温下为白色或透明的蜡状固体。樟脑提炼自樟树干中，树龄越老的的樟树所富含樟脑比例越多。提炼方法为将树干切成小块用水蒸馏，樟脑油受热后随着水蒸汽上升，在接触到预先放置在上方的陶缸冷却后便可形成樟脑。现在世界上使用的樟脑丸多是由化学方式合成，合成樟脑的功效不及天然樟脑，且副作用大。通过探寻和阐释萜类成分在龙脑樟中的生物合成途径及其调控机制，有助于为药材品质的形成提供理论基础，同时为利用生物技术提高目标成分含量或直接生产有效成分带来广阔的应用空间。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供龙脑樟冰片脱氢酶CcBDH3基因及其编码产物与应用。本专利技术首先提供了一种蛋白质，所述蛋白质为CcBDH3，来源于龙脑樟树，命名为龙脑樟冰片脱氢酶CcBDH3，是如下a)或b)或c)的蛋白质：a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述蛋白质中，蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。在本专利技术的实施例中，所述融合蛋白为氨基酸序列是序列3所示的蛋白质。上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gapexistencecost，Perresiduegapcost和Lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。上述蛋白质中，所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。与CcBDH3的相关生物材料也在本专利技术的保护范围之内。本专利技术提供的与CcBDH3的相关生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：A1)编码权利要求1所述的蛋白质的核酸分子；A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。上述生物材料中，A1)所述核酸分子为如下B1)-B5)任一所示：B1)序列表中序列1所示的DNA分子；B2)编码序列是序列表中序列1所示的DNA分子；B3)序列表中序列4所示的DNA分子；B4)编码序列是序列表中序列4所示的DNA分子；B5)在严格条件下与B1)或B2)或B3)或B4)限定的DNA分子杂交，且编码CcBDH3的DNA分子。所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。其中，所述核酸分子可以为DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA，所述核酸分子也可以为RNA，如mRNA或hnRNA。上述生物材料中，A2)所述的含有编码CcBDH3的核酸分子的表达盒(CcBDH3基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达CcBDH3的DNA，该DNA不但可包括启动CcBDH3转录的启动子，还可包括终止CcBDH3转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。上述生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。本专利技术进一步提供了上述蛋白质或其相关生物材料的应用。所述应用具体如下所示：(A)上述蛋白质作为单萜合酶的应用；(B)上述相关生物材料在制备单萜合酶中的应用；(C)上述蛋白质或相关生物材料在制备或合成萜类化合物中的应用；(D)上述蛋白质或相关生物材料在催化右旋龙脑形成右旋樟脑中的应用；(E)上述蛋白质或相关生物材料在催化左旋龙脑形成左旋樟脑中的应用。上述应用中，所述萜类化合物为单萜类化合物。所述单萜类化合物为右旋樟脑或左旋樟脑。本专利技术制备CcBDH3的方法，包括将CcBDH3的编码基因导入到受体微生物中，得到表达CcBDH3的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到CcBDH3。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.蛋白质，是如下a)或b)或c)的蛋白质：/na)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；/nb)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；/nc)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。/n

【技术特征摘要】
1.蛋白质，是如下a)或b)或c)的蛋白质：
a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；
b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。


2.与权利要求1所述的蛋白质相关的生物材料，为下述A1)至A12)中的任一种：
A1)编码权利要求1所述的蛋白质的核酸分子；
A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；
A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。


3.根据权利要求2所述的相关生物材料，其特征在于：A1)所述核酸分子为如下B1)-B5)任一所示：
B1)序列表中序列1所示的DNA分子；
B2)编码序列是序列表中序列1所示的DNA分子；
B3)序列表中序列4所示的DNA分子...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄璐琦，马蕊，苏平，崔光红，郭娟，
申请(专利权)人：中国中医科学院中药研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11