本发明专利技术提供了羰基还原酶，能够高浓度转化1‑(2‑甲氧基‑3‑溴苯基)乙酮的能力，并且具有高的立体选择性。本发明专利技术提供的重组细胞作为生物催化剂，能以高底物投料浓度，获得高收率的目标产物，副产物少，产率不低于95％，而且转化时间短，所用生物催化剂用量少，时空产率远高于目前报道水平，制备方法简单方便、条件温和、环境友好。
【技术实现步骤摘要】
制备(S)-1-(2-甲氧基-3-溴苯基)乙醇的方法
本专利技术涉及酶及酶工程领域，具体地，本专利技术涉及羰基还原酶在催化抗血小板减少症新药Lusutrombopag中间体制备(S)-1-(2-甲氧基-3-溴苯基)乙醇的方法中的应用。
技术介绍
抗血小板减少症新药Lusutrombopag是一款口服的、小分子的人血小板生成素受体激动剂，诱发内源性血小板生成，已被批准在美国、欧盟和日本上市，作为常规药物在临床使用。Lusutrombopag能与巨核细胞表面的TPO受体相结合，诱导这些细胞的增殖、分化、与成熟，从而上调血小板的产生。这款创新疗法已于2015年9月获得日本厚生劳动省的批准，在选择进行侵入性手术的慢性肝脏疾病患者中，改善他们的血小板减少症病情。中国约有1360万慢性肝病成人患者，其中多数患者会接受选择性侵入性治疗。另一方面，由于患者在更高水平医疗护理中对于输血需求的不断增加，加之无偿献血的比例要低于欧洲、美国和日本，因此国内长期面临血液库存短缺的问题。另外，众所周知，采集的血液有较高的传播感染性疾病风险。在现在中国血液供应的大环境下，Lusutrombopag在中国的上市，与输血小板相比，无疑是一种更优的选择。药物Lusutrombopag结构中存在手性结构可以通过手性醇引入，其关键手性中间体可以通过1-(2-甲氧基-3-溴苯基)乙酮的羰基不对称还原实现。目前已报道的能够实现1-(2-甲氧基-3-溴苯基)乙酮的羰基不对称还原使用反应试剂为硼烷四氢呋喃或者硼烷二甲硫醚，催化剂为(R)-2-甲基-CBS-恶唑硼烷或者(S)-2-甲基-CBS-恶唑硼烷，反应所使用溶剂为四氢呋喃或者甲苯。有机试剂以及硼烷试剂的使用，对环境的压力较大。羰基还原酶能够在反应溶剂为水溶液，常温常压下实现羰基的还原，因此使用羰基还原酶还原底物1-(2-甲氧基-3-溴苯基)乙酮的羰基不对称还原是非常有吸引力的。
技术实现思路
针对现有技术的不足及实际的需求，本专利技术提供了一种羰基还原酶及其在催化合成(S)-1-(2-甲氧基-3-溴苯基)乙醇化合物中的应用。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供了一种羰基还原酶，其氨基酸序列与为SEQIDNO：1具有至少90％同一性，且所述的羰基还原酶具有转化1-(2-甲氧基-3-溴苯基)乙酮生成(S)-1-(2-甲氧基-3-溴苯基)乙醇的能力。优选地，所述羰基还原酶来源于Novosphingobium。第二方面，本专利技术提供了一种重组细胞，所述重组细胞表达了第一方面所述的羰基还原酶，还表达了能够催化NAD+合成NADH的葡萄糖脱氢酶(GDH)或者甲酸脱氢酶(FDH)。第三方面，本方面提供了一种制备(S)-1-(2-甲氧基-3-溴苯基)乙醇的方法，将本专利技术第二方面所述的重组细胞与反应底物接触，进行催化反应，从而获得(S)-1-(2-甲氧基-3-溴苯基)乙醇。在另一优选例中，所述反应具有选自下组的一个或多个特点：(i)反应体系的pH为5.0-9.0，较佳地，5.0-8.0，更佳地，7.0；(ii)反应体系助溶剂为无助溶剂，乙腈、丙酮、甲醇、乙醇、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、二氯甲烷、1,4-二氧己环，较佳地，甲醇、乙醇、N，N-二甲基甲酰胺、异丙醇，更佳地，N，N-二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇、异丙醇。(iii)所述催化反应的温度为20-60℃，较佳地，25-50℃，更佳地，25-32℃。(iiii)反应时间为1-24小时，较佳地，5-12小时。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：(i)本专利技术提供了羰基还原酶，能够高浓度转化1-(2-甲氧基-3-溴苯基)乙酮的能力，并且具有高的立体选择性。(ii)本专利技术提供的重组细胞作为生物催化剂，能以高底物投料浓度，获得高收率的目标产物，副产物少，产率不低于95％，而且转化时间短，所用生物催化剂用量少，时空产率远高于目前报道水平，制备方法简单方便、条件温和、环境友好。附图说明图1所示的是1-(2-甲氧基-3-溴苯基)乙酮标样的HPLC图；图2所示的是1-(2-甲氧基-3-溴苯基)乙醇消旋体HPLC图；图3所示的是(S)-1-(2-甲氧基-3-溴苯基)乙醇的HPLC图；具体实施方式为更进一步阐述本专利技术所采取的技术手段及其效果，以下通过具体实施方式来进一步说明本专利技术的技术方案，但本专利技术并非局限在实施例范围内。实施例1：羰基还原酶(CBR)重组表达质粒和重组表达转化体的制备将SEQIDNo.1的序列全合成后，连接在pET21a载体上，然后转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，挑取阳性克隆，即获得重组表达转化体E.coliBL21(DE3)/pET-21a-CBR。实施例2：羰基还原酶CBR与葡萄糖脱氢酶(GDH)共表达重组细胞的构建以实施例1中已构建好的羰基还原酶基因以及实验室已有的葡萄糖脱氢酶SEQIDNo.3基因为模板，利用PCR手段扩增这些突变体基因和GDH基因，纯化后分别连接到共表达载体pRSFDuet的两个阅读框，验证成功后转化大肠杆菌感受态BL21(DE3)中，挑取阳性克隆，即获得CBR与GDH共表达的重组细胞。实施例3：羰基还原酶CBR与甲酸脱氢酶(FDH)共表达重组细胞的构建以实施例1中已构建好的羰基还原酶CBR基因以及实验室已有的甲酸脱氢酶基因为模板，利用PCR手段扩增这些突变体基因和FDHSEQIDNo.2基因，纯化后分别连接到共表达载体pRSFDuet的两个阅读框，验证成功后转化大肠杆菌感受态BL21(DE3)中，挑取阳性克隆，即获得CBR与FDH共表达的重组细胞。实施例4：羰基还原酶CBR与葡萄糖脱氢酶(GDH)共表达重组细胞制备(S)-1-(2-甲氧基-3-溴苯基)乙醇配置种子液50mL，培养基为LB培养基，用接种环挑取构建好的pRSFDuet-CBR-GDH的基因工程菌单菌落接入培养基中，37℃，200rpm培养过夜。将过夜培养的种子液以1％的接种量转接到发酵培养基(LB培养基)，37℃，200rpm培养至OD600为0.6-1.0左右，加入0.1mM的IPTG，并置于25℃，200rpm诱导10～16h。4℃，6000rpm条件下离心收集菌体，以菌体作为生物催化剂。(1)取菌体重悬于100mL磷酸缓冲液(pH7.0，100mM)，菌体浓度为20g/l，加入底物1-(2-甲氧基-3-溴苯基)乙酮(10％v/v甲醇)至终浓度为15g/L，葡萄糖45g/L，30℃，200r/min的摇床上反应，反应过程中控制pH值在7.0，8h后停止反应。反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，转化率>95％，ee值>99％(S)。图2所示的是1-(2-甲氧基-3-溴苯基)乙醇消旋体HPLC图；图3所示的是(S)-1-本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种具有转化1-(2-甲氧基-3-溴)苯基乙酮羰基为S-构型醇羰基还原酶，其特征在于，所述羰基还原酶来源于Novosphingobium,其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示。/n
【技术特征摘要】
1.一种具有转化1-(2-甲氧基-3-溴)苯基乙酮羰基为S-构型醇羰基还原酶，其特征在于，所述羰基还原酶来源于Novosphingobium,其氨基酸序列如序列表中SEQIDNo.1所示。
2.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞表达了权利要求1所述的羰基还原酶突，还表达了能够催化NAD+合成NADH的甲酸脱氢酶(FDH)，氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。
3.一种...
【专利技术属性】
技术研发人员：崔云凤，姚培圆，陈曦，张红榴，张瑞，冯进辉，吴洽庆，朱敦明，马延和，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12
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