【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物催化，涉及一种醛缩酶突变体，还涉及一种利用醛缩酶和泛酸合成酶例如泛酸-β-丙氨酸连接酶偶联催化甲酸和2,2-二甲基-3-羟基丙醛反应制备维生素b5的方法。
技术介绍
1、维生素b5(vb5)又称遍多酸或泛酸，cas号137-08-6，是一种水溶性维生素，它是能量代谢所必需的微量营养素，且是合成辅酶a和酰基载体蛋白的关键前体，辅酶a对脂肪酸代谢和柠檬酸循环至关重要。维生素b5属维生素类药物，是人和动物体内辅酶a的成分之一。在泛酸的异构体中，只有d型具有维生素活性，参与蛋白质、脂肪、碳水化合物的新陈代谢，治疗维生素b缺乏症、周围神经炎以及手术后的肠绞痛等。
2、维生素b5的合成方法主要是化学法，主要有以下几种：1)将d-泛解酸内酯与3-氨基丙酸钙混合在甲醇介质中发生酰化反应得到维生素b5。2)采用草酸二乙酯-异丁醛-甲醛法合成酮基泛内酯，酮基泛内酯加氢后再用碳酸胍拆分出d-泛酸胍，制得d-泛解酸内酯，与3-氨基丙酸和金属钙反应制备维生素b5。3)采用3-氨基丙腈与氢氧化钠或氢氧化钾反应，后用盐酸中和进行钙离子树脂交换，再与d-泛解酸内酯酰化反应制备维生素b5。以上合成维生素b5的方法耗费时间长，需要大量的化学试剂并对环境造成污染，原料价格昂贵，产物收率低，不利于大规模的工业化生产。
3、利用生物催化技术制备维生素b5的研究近年来已有报道，例如专利文献cn114657221a报道了使用包含l-氨基酸脱氨酶、甲酸脱氢酶、醛缩酶、酮泛解酸还原酶和泛酸合成酶的五种酶的复合酶为生物催化剂体系，以缬氨酸
技术实现思路
1、为了探索一种高效、经济的vb5生产方法，本研究从生物合成方法改进着手，改变了反应途径，相应地改变了反应底物种类和酶类型，开发出一种新的vb5制备方法。以甲酸和2,2-二甲基-3-羟基丙醛二种化合物为底物，通过醛缩酶与泛酸合成酶两种酶的联合催化，成功实现了维生素b5的制备，而且d-泛酸产品具有高光学纯度。进一步地，专利技术人还对该天然酶基因进行定向进化改造，筛选获得了酶活性显著提高的突变体，提高了新制备方法的可行性。因此，本专利技术包括如下技术方案。
2、一种醛缩酶突变体，其为选自下组的多肽：
3、(1)氨基酸序列为seq id no:3的多肽；
4、(2)与seq id no:3有90％以上同源性、且酶活力相比seq id no:3提高的多肽。
5、mlffidtanideikeayelgtlagvttnpslvakeadvsfhdrlreitevvkgsvsaevislnaeemieegaelakiapnitvkipmtseglkavkalsdlniktnvtlifsanqallaaragatyvspflgrlddighngleliseirqhfdlhdidtqiiaasirhaqhvteaalrgahigtmplkfihqltkhpltdkgieqfladwnk(seq idno:3)。
6、其为枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)来源的野生醛缩酶seq id no:1第21位的v替换为t、第72位的k替换为a、第151位的i替换为h、第189位的v替换为f的突变体。野生醛缩酶的氨基酸序列为：
7、mlffidtanideikeayelgvlagvttnpslvakeadvsfhdrlreitevvkgsvsaevislnaeemieegkelakiapnitvkipmtseglkavkalsdlniktnvtlifsanqallaaragatyvspflgrlddighngleliseirqifdlhdidtqiiaasirhaqhvteaalrgahigtmplkvihqltkhpltdkgieqfladwnk(seq idno:1)。
8、本专利技术的第二个方面提供了一种编码上述醛缩酶突变体的基因。例如，编码seqid no:3的基因可以是核苷酸序列seq id no:4。
9、上述的醛缩酶seq id no:1及其突变体例如seq id no:3可以用于合成维生素b5。
10、本专利技术的另一个方面提供了一种酶催化制备维生素b5的方法，包括如下步骤：以甲酸和2,2-二甲基-3-羟基丙醛为底物，用醛缩酶seq id no:1或者醛缩酶突变体例如seqid no:3与泛酸合成酶联合催化反应，得到维生素b5。
11、
12、可选地，上述泛酸合成酶是一种泛酸-β-丙氨酸连接酶(pantoate-beta-alanineligase)。在一种实施方式中，上述泛酸合成酶的氨基酸序列为seq id no:5：mliietlpllrqqirrlrmegkrvalvptmgnlhdghmklvdeakaradvvvvsifvnpmqfdrpedlaryprtlqedceklnkrkvdlvfapsvkeiypngtethtyvdvpglstmlegasrpghfrgvstivsklfnlvqpdiacfgekdfqqlalirkmvadmgfdieivgvpimrakdglalssrngyltaeqrkiapglykvlssiadklqagerdldeiitiagqelnekgfraddiqirdadtllevsetskravilvaawlgdarlidnkmvela(seq id no:5)。
13、可选地，所述维生素b5呈盐形式例如呈泛酸钙形式。
14、反应体系中，所述醛缩酶、醛缩酶突变体和泛酸合成酶既可以是游离酶，也可以是固定化酶，甚至可以呈表达微生物菌体形式。
15、反应体系ph值为6.5-8.5，反应温度为15-45℃。
16、与现有技术相比，本专利技术开发的联合酶催化法制备维生素b5的工艺所需酶种类少、底物种类少，显著降低了生产成本，而且产物光学纯度高，ee值不低于99％，具有开发应用价值。
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1.一种醛缩酶突变体，其为选自下组的多肽：
2.编码如权利要求1所述醛缩酶突变体的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，编码SEQ ID NO:3的基因是核苷酸序列SEQID NO:4。
4.如权利要求1所述的醛缩酶突变体在合成维生素B5中的用途。
5.一种酶催化制备维生素B5的方法，包括如下步骤：以甲酸和2,2-二甲基-3-羟基丙醛为底物，用氨基酸序列为SEQ ID NO:1的醛缩酶或者如权利要求1所述的醛缩酶突变体与泛酸合成酶联合催化反应，得到维生素B5。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述泛酸合成酶是一种泛酸-β-丙氨酸连接酶。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述泛酸合成酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:5。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，维生素B5呈盐形式例如呈泛酸钙形式。
9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述醛缩酶、醛缩酶突变体和泛酸合成酶为游离酶或者固定化酶。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，反应体系p
...【技术特征摘要】
1.一种醛缩酶突变体，其为选自下组的多肽：
2.编码如权利要求1所述醛缩酶突变体的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，编码seq id no:3的基因是核苷酸序列seqid no:4。
4.如权利要求1所述的醛缩酶突变体在合成维生素b5中的用途。
5.一种酶催化制备维生素b5的方法，包括如下步骤：以甲酸和2,2-二甲基-3-羟基丙醛为底物，用氨基酸序列为seq id no:1的醛缩酶或者如权利要求1所述的醛缩酶突变体与泛酸合成酶联合催化反应，得到维生素b5...
【专利技术属性】
技术研发人员：范文超，
申请(专利权)人：洛阳华荣生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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