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【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物发酵培养,具体地说,涉及一种发酵生产l-苏氨酸的方法、培养基及其应用。
技术介绍
1、l-苏氨酸(l-threonine),化学名称β-羟基-α-氨基丁酸,分子式c4h9no3,相对分子质量为119.12。l-苏氨酸是一种必需氨基酸,主要用于医药、化学试剂、食品强化剂、饲料添加剂等诸多方面。
2、l-苏氨酸是人体必需氨基酸之一,具有恢复疲劳、促进生长发育的效果。目前,微生物发酵法生产l-苏氨酸工艺主要包括l-苏氨酸发酵、提取两部分,l-苏氨酸发酵主要是采用大肠杆菌以玉米淀粉水解糖或糖蜜为碳源、以玉米浆、水解液、酵母膏、蛋白胨和铵盐、硝酸盐、尿素、氨水和液氨等为氮源发酵法生产。其工艺优化一般包括溶氧、控制碳源和氮源、甜菜碱用量和其他维生素等。
3、但发酵仍存在细菌生长和生产的冲突的问题,为了更好的解决这个问题,一般是前期以培养细菌为主,细菌长够了之后,强制进行转型,一般采用的转型方式是限制营养、提高温度等对细菌不利的方法,以限制细菌的生长,避免细菌生与于生产争夺碳源、氮源等营养物质。如中国专利技术专利cn112322673a“一种谷氨酸的发酵方法”,其发酵控制初始培养温度为32℃;当相对生长△od=0.3左右时(此为发酵液稀释20倍浓度在620nm处的od值),转换温度到37℃,△od=0.6时,再次提高温度到38℃继续发酵至结束。又如,中国专利cn111356767a通过限制至少两种限制性营养源增强脂质的产生,这种限制性营养源包括氮源,磷酸盐源,维生素源(例如维生素b2源,泛酸源,硫胺
4、总结现有技术存在的主要问题有:
5、1、大部分发酵无转型,细菌持续增长和生产苏氨酸抢夺碳源氮源和营养物质;
6、2、现有的发酵转型包括提高温度抑制菌体生长转型产酸,对细菌有不利影响;
7、3、使用iptg等诱导超表达不能解决降解问题;
8、4、使用阿拉伯糖、乳糖诱导使用量大;
9、5、苏氨酸降解后生成的异亮氨酸对天冬氨酸激酶抑制无法解决。
10、因此,有必要对苏氨酸的发酵生产进行进一步研究。
技术实现思路
1、为了克服现有技术的缺点,本专利技术提供一种可既不影响菌体细胞其他功能,又可有效提升苏氨酸发酵生产转化率的方法。
2、为了实现该目的,本专利技术的技术方案如下:
3、一种发酵生产l-苏氨酸的方法,其在发酵培养开始前,直接在初始发酵培养基中加入β-氯-l-丙氨酸,或者,使用初始发酵培养基进行发酵培养,待进行到发酵总时长的55-60%时,在发酵培养基中加入β-氯-l-丙氨酸。
4、β-氯-l-丙氨酸(β-chloro-l-alanine)是抑制多种酶的抑菌氨基酸类似物,可以抑制多种酶的活性,并具有不会破坏细胞dna、细胞壁等特点。本专利技术研究发现,当将其加入得到苏氨酸发酵培养中时,可有效抑制产物降解,帮助提升苏氨酸的产量。尤其是,当对加入β-氯-l-丙氨酸的时机进行控制时,可进一步减少该抑制剂对发酵菌生长的影响,从而进一步提升产量。
5、本专利技术的方法中,β-氯-l-丙氨酸在所述初始发酵培养基或所述发酵培养基中的浓度为10-20μg/l,优选为10μg/l,可既控制成本,又减少对发酵菌od值的影响,进而有效提升产量。
6、本专利技术的方法中,所述初始发酵培养基包括:玉米浆5-25g/l,水解液5-10g/l,葡萄糖38-42g/l,mgso4·7h2o 0.4-0.6g/l,kh2po4 1.8-2.2g/l,feso4 18-22mg/l,mnso4 18-22mg/l,znso4 0.04-0.06mg/l,(nh4)2so4 4-6g/l;
7、优选包括:玉米浆5g/l,水解液5g/l,葡萄糖40g/l,mgso4·7h2o 0.5g/l,kh2po42g/l,feso4 20mg/l,mnso4 20mg/l,znso4 0.05mg/l,(nh4)2so4 5g/l。
8、本专利技术的培养基各组分合理配合,可充分发挥提升苏氨酸产量的效果。
9、本专利技术的方法中,所述初始发酵培养基还包括:亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和柠檬酸。
10、优选,所述亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸的质量比为1:(1.3-1.7):(1.3-1.7),更优选为1:(1.4-1.6):(1.4-1.6),进一步优选为1:1.5:1.5。
11、优选,所述谷氨酸、天冬氨酸和柠檬酸的质量比为1:(0.8-1.2):(0.8-1.2),更优选为1:(0.9-1.1):(0.9-1.1),进一步优选为1:1:1。
12、本专利技术进一步研究发现,虽然β-氯-l-丙氨酸能通过抑制产物分解而提升苏氨酸的产量,但由于β-氯-l-丙氨酸对酶的抑制性并不是专一的,其会同时影响多种酶的活性,因此也会在某些方面阻碍苏氨酸产量的进一步提升。为此,本专利技术经反复摸索研究,最终发现在培养基中加入特定的氨基酸组合,可弥补β-氯-l-丙氨酸加入后对苏氨酸产量提升的某些不期望的影响,进而使得苏氨酸产量得以进一步提升。
13、本专利技术发现当同时以特定比例加入亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸后,可进一步避免β-氯-l-丙氨酸对发酵菌生长的影响。
14、当同时以特定比例加入谷氨酸、天冬氨酸和柠檬酸后,可进一步配合促进苏氨酸的生产,将产量进一步大幅提升。
15、本专利技术的方法中,所述初始发酵培养基还包括:0.1-0.3g/l的亮氨酸、0.2-0.4g/l的缬氨酸、0.2-0.4g/l的异亮氨酸、0.8-1.2g/l的谷氨酸、0.8-1.2g/l的天冬氨酸和0.8-1.2g/l的柠檬酸;
16、优选还包括:0.2g/l的亮氨酸、0.3g/l的缬氨酸、0.3g/l的异亮氨酸、1g/l的谷氨酸、1g/l的天冬氨酸和1g/l的柠檬酸。
17、本专利技术的方法中,发酵培养的条件为:通气量0.7-0.9vvm,转速300-600rpm,培养ph7.0-7.2,温度36-38℃,溶氧28-32%;
18、优选,通气量0.8vvm,转速300rpm-600rpm,培养ph7.0,温度37℃,溶氧30%;
19、待发酵液中残糖量为0.1-0.2g/l时开始流加葡萄糖,使葡萄糖的浓度控制在0-1g/l,氮源氨水作为ph调节剂;
20、和/或,发酵菌为可生产苏氨酸的大肠杆菌。
21、作为具体优选实施方式,本专利技术方法包括:
22、1、初始培养基添加β-氯-l-丙氨酸:
23、(1)本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种发酵生产L-苏氨酸的方法,其特征在于,在发酵培养开始前,直接在初始发酵培养基中加入β-氯-L-丙氨酸,或者,使用初始发酵培养基进行发酵培养,待进行到发酵总时长的55-60%时,在发酵培养基中加入β-氯-L-丙氨酸。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,β-氯-L-丙氨酸在所述初始发酵培养基或所述发酵培养基中的浓度为10-20μg/L,优选为10μg/L。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述初始发酵培养基包括:玉米浆5-25g/L,水解液5-10g/L,葡萄糖38-42g/L,MgSO4·7H2O 0.4-0.6g/L,KH2PO4 1.8-2.2g/L,FeSO4 18-22mg/L,MnSO4 18-22mg/L,ZnSO4 0.04-0.06mg/L,(NH4)2SO4 4-6g/L;
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述初始发酵培养基还包括:亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和柠檬酸。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸的质量比为1:(1.3-
6.根据权利要求4或5所述的方法,其特征在于,所述谷氨酸、天冬氨酸和柠檬酸的质量比为1:(0.8-1.2):(0.8-1.2),优选为1:1:1。
7.根据权利要求4-6任一项所述的方法,其特征在于,所述初始发酵培养基还包括:0.1-0.3g/L的亮氨酸、0.2-0.4g/L的缬氨酸、0.2-0.4g/L的异亮氨酸、0.8-1.2g/L的谷氨酸、0.8-1.2g/L的天冬氨酸和0.8-1.2g/L的柠檬酸;
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法,其特征在于,发酵培养的条件为:通气量0.7-0.9vvm,转速300-600rpm,培养pH7.0-7.2,温度36-38℃,溶氧28-32%;
9.一种发酵生产L-苏氨酸的培养基,其特征在于,包括:玉米浆5-25g/L,水解液5-10g/L,葡萄糖38-42g/L,MgSO4·7H2O 0.4-0.6g/L,KH2PO4 1.8-2.2g/L,FeSO4 18-22mg/L,MnSO418-22mg/L,ZnSO40.04-0.06mg/L,(NH4)2SO4 4-6g/L,β-氯-L-丙氨酸10-20μg/L;优选进一步包括:0.1-0.3g/L的亮氨酸、0.2-0.4g/L的缬氨酸、0.2-0.4g/L的异亮氨酸、0.8-1.2g/L的谷氨酸、0.8-1.2g/L的天冬氨酸和0.8-1.2g/L的柠檬酸;
10.权利要求1-8任一项所述的方法或权利要求9所述的培养基在提升发酵生产苏氨酸转化率上的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种发酵生产l-苏氨酸的方法,其特征在于,在发酵培养开始前,直接在初始发酵培养基中加入β-氯-l-丙氨酸,或者,使用初始发酵培养基进行发酵培养,待进行到发酵总时长的55-60%时,在发酵培养基中加入β-氯-l-丙氨酸。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,β-氯-l-丙氨酸在所述初始发酵培养基或所述发酵培养基中的浓度为10-20μg/l,优选为10μg/l。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述初始发酵培养基包括:玉米浆5-25g/l,水解液5-10g/l,葡萄糖38-42g/l,mgso4·7h2o 0.4-0.6g/l,kh2po4 1.8-2.2g/l,feso4 18-22mg/l,mnso4 18-22mg/l,znso4 0.04-0.06mg/l,(nh4)2so4 4-6g/l;
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述初始发酵培养基还包括:亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和柠檬酸。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸的质量比为1:(1.3-1.7):(1.3-1.7),优选为1:1.5:1.5。
6.根据权利要求4或5所述的方法,其特征在于,所述谷氨酸、天冬氨酸和柠檬酸的质量比为1:(0.8-1.2):(0.8-1.2),...
【专利技术属性】
技术研发人员:宫卫波,袁二影,王晓平,赵津津,李岩,
申请(专利权)人:廊坊梅花生物技术开发有限公司,
类型:发明
国别省市:
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