构建R-3-氨基丁酸生产菌的方法技术

本发明专利技术通过基因工程构建了一种R

【技术实现步骤摘要】
构建R
‑3‑
氨基丁酸生产菌的方法


[0001]本专利技术属于基因工程领域，具体地说，涉及一种能够通过发酵直接产生R
‑3‑
氨基丁酸的基因工程生产菌及其构建方法。

技术介绍

[0002]R
‑3‑
氨基丁酸，CAS号3775
‑
73
‑
3，是合成抗HIV新药度鲁特韦的重要中间体，目前该化合物的合成方法主要有化学合成法和酶催化法。化学合成法反应条件苛刻，需要使用大量化工原料，成本较高，重金属污染，不利于工业化大生产。酶催化法，一般需要使用化工原料丁烯酸做底物，经天冬氨酸酶或突变体可以制备R
‑3‑
氨基丁酸。两种工艺均对化工原料生产供应有高度的依赖型。
[0003]以经济的微生物发酵法生产R
‑3‑
氨基丁酸是一种值得探索的研究方向。迄今为止，尚没有通过发酵法生产R
‑3‑
氨基丁酸的文献报道。因此，构建能够直接生物合成R
‑3‑
氨基丁酸的工程菌具有挑战性，将会是一种走向工业化应用的技术突破。

技术实现思路

[0004]为了研究发酵法生产R
‑3‑
氨基丁酸的可行性，专利技术人通过代谢工程来改造工业上最常用的基因工程菌宿主大肠杆菌，使得大肠杆菌过表达下列酶的基因：3
‑
酮硫裂解酶(phbA)或乙酰乙酰辅酶合成酶(atoB)、乙酰乙酰辅酶A还原酶(PhbB)、3
‑
羟基丁酰辅酶A脱水酶(3/>‑
hydroxybutyryl
‑
CoA dehydratase)、硫酯酶(thioesterase)、氨基裂合酶或称天冬氨酸氨裂合酶(AspB)，以便实现R
‑3‑
氨基丁酸的生物合成，最终获得了一株能够产生R
‑3‑
氨基丁酸的工程菌。具体而言，本专利技术包括如下技术方案。
[0005]一种构建R
‑3‑
氨基丁酸生产菌的方法，其包括以下步骤：
[0006]A.构建用于实现巴豆酸(又名丁烯酸)合成的质粒A，其包含下述酶的基因：
[0007]3‑
酮硫裂解酶(PhbA)或者乙酰乙酰辅酶合成酶(AtoB)，
[0008]乙酰乙酰辅酶A还原酶(PhbB)，
[0009]巴豆酸酶(crotonase，Crt，又称烯酰水合酶、3
‑
羟基丁酰辅酶A脱水酶，3
‑
hydroxybutyryl
‑
CoA dehydratase)，以及
[0010]硫酯酶(thioesterase，YdiI)，
[0011]该质粒A可以在微生物比如大肠杆菌中构建巴豆酸(丁烯酸)合成途径；
[0012]B.构建用于表达氨基裂合酶，优选天冬氨酸氨裂合酶(AspB)的质粒B；
[0013]C.将对步骤A中所构建的质粒A和步骤B中所构建的质粒B共转入大肠杆菌中，得到同时表达3
‑
酮硫裂解酶(phbA)或乙酰乙酰辅酶合成酶(atoB)、乙酰乙酰辅酶A还原酶(PhbB)、巴豆酸酶(Crt)、硫酯酶(YdiI)和氨基裂合酶(优选天冬氨酸氨裂合酶AspB)基因的阳性克隆；
[0014]D.从步骤C中所构建的阳性克隆中，筛选出生产R
‑3‑
氨基丁酸的菌株。
[0015]其中，上述质粒A的构建可以包括下述步骤：
[0016]A
‑
1.将3
‑
酮硫裂解酶基因phbA、乙酰乙酰辅酶A还原酶基因phbB、巴豆酸酶基因crt和硫酯酶基因ydiI用核糖体结合位点(ribosomebinding site，RBS)序列rbs串联起来，得到表达这4个基因的表达元件phbA
‑
phbB
‑
crt
‑
ydiI；
[0017]A
‑
2.将步骤A
‑
1中所构建的表达元件phbA
‑
phbB
‑
crt
‑
ydiI装载到载体pTrcHis2B的BamH1/HindIII位点之间，Trc启动子下游，获得pTrcHis2B
‑
ABcy质粒即质粒A。
[0018]上述步骤C中的质粒转入可以是氯化钙转化法或电转化，优选电转化。
[0019]优选地，上述3
‑
酮硫裂解酶(PhbA)基因为NCBI:J04987；
[0020]上述乙酰乙酰辅酶A还原酶(PhbB)基因为NCBI:L01112；
[0021]上述巴豆酸酶来源于贝氏梭状芽胞杆菌(Clostridium beijerinckii)，其基因编号为GenBank:AGF54251.1(KEGG，csr:Cspa_c04330 K01715)；
[0022]上述硫酯酶(thioesterase，YdiI)的基因为Gene ID:946190。
[0023]优选上述表达元件phbA
‑
phbB
‑
crt
‑
ydiI的核苷酸序列是SEQ ID NO:1。
[0024]在一种实施方式中，上述质粒B的构建可以包括下述步骤：
[0025]将天冬氨酸氨裂合酶基因AspB克隆到载体pCDFDuet
‑
1的NcoI/NotI位点之间，T7启动子下游，获得pCDF
‑
AspB质粒。
[0026]优选上述天冬氨酸氨裂合酶AspB的基因为SEQ ID NO:2，其是专利文献CN110791493A中报道的(N142V、H188A)突变体基因SEQ ID NO:4，在本文实施例中也沿用称为AspB
‑
11
‑
D4。
[0027]相对应地，野生型天冬氨酸氨裂合酶在本文实施例中也沿用称为AspB1，其编码基因是SEQ ID NO:3，是专利文献CN110791493A中报道的密码子优化基因SEQ ID NO:2。
[0028]本专利技术的第二个目的在于提供一种R
‑3‑
氨基丁酸生产菌，其通过上述的方法构建和筛选得到。
[0029]该生产菌可以是基因工程中应用最广泛的宿主
‑
大肠杆菌，优选大肠杆菌BL21(DE3)或者大肠杆菌MG1655。
[0030]优选的R
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氨基丁酸生产菌已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏编号为CGMCC No.22076。
[0031]本专利技术的第三个目的在于提供上述R
‑3‑
氨基丁酸生产菌比如CGMCC No.22076用于生产R
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氨基丁酸的用途。
[0032]具体地，可以通过上述R...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种构建R
‑3‑
氨基丁酸生产菌的方法，其包括以下步骤：A.构建用于实现巴豆酸合成的质粒A，其包含3
‑
酮硫裂解酶(PhbA)或乙酰乙酰辅酶合成酶(AtoB)、乙酰乙酰辅酶A还原酶(PhbB)、巴豆酸酶(Crt)和硫酯酶(YdiI)的基因；B.构建用于表达天冬氨酸氨裂合酶(AspB，或称氨基裂合酶)的质粒B；C.将对步骤A中所构建的质粒A和步骤B中所构建的质粒B共转入大肠杆菌中，得到阳性克隆；D.从步骤C中所构建的阳性克隆中，筛选出生产R
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氨基丁酸的菌株。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质粒A的构建包括下述步骤：A
‑
1.将3
‑
酮硫裂解酶基因phbA、乙酰乙酰辅酶A还原酶基因phbB、巴豆酸酶基因crt和硫酯酶基因ydiI用核糖体结合位点(ribosomebinding site，RBS)序列rbs串联起来，得到表达这4个基因的表达元件phbA
‑
phbB
‑
crt
‑
ydiI；A
‑
2.将步骤A
‑
1中所构建的表达元件phbA
‑
phbB
‑
crt
‑
ydiI装载到载体pTrcHis2B的BamH1/HindIII位点之间，Trc启动子下游，获得pTrcHis2B
‑
ABcy质粒即质粒A。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表达元件phbA
‑
phbB
‑
crt
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【专利技术属性】
技术研发人员：范文超，高书良，丁鹏，
申请(专利权)人：洛阳华荣生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：