一种L-赖氨酸脱羧酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种L‑赖氨酸脱羧酶突变体及其应用，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3，能够有效催化L‑赖氨酸的脱羧反应、但不催化D‑赖氨酸反应，从而通过外消旋体拆分法制备D‑赖氨酸，具有较好的工业化应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种L-赖氨酸脱羧酶突变体及其应用
本专利技术属于基因工程和酶催化
，具体地说，涉及一种L-赖氨酸脱羧酶(L-lysinedecarboxylase，LdcA)突变体、及其在通过外消旋体拆分法制备D-赖氨酸中的用途。
技术介绍
D-型氨基酸多为人工合成氨基酸，但在许多植物、微生物和高等植物中都有D-氨基酸的存在，它在医药、食品和新型农药方法有广泛的用途，科研人员在海洋嗜热菌中也鉴定到了D-赖氨酸合成途径的存在。D-赖氨酸(D-Lys)是合成促黄体生成素释放激素(LHRH)类似物和促性腺激素释放激素(GnRH)高活性类似物前体，口服或者静脉注射给药均可以降低肿瘤治疗中放射性肽的肾摄取。D-赖氨酸多聚物能够促进软管细胞和脑星形胶质细胞增殖，也是良好的药物载体。目前国内外制备D-赖氨酸的方法有化学法、化学生物偶联法、生物酶法等。化学法的原理是，赖氨酸属于碱性氨基酸，可与手性酸生成非对映体盐，再通过非对映体盐的溶解度差异进行分离。例如，以L-赖氨酸盐酸盐为原料，用稀乙酸加水杨醛消旋得到DL-Lys，再以L-酒石酸为手性拆分剂化学拆分，并以无机钙盐进行分离纯化，最终D-Lys最高收率为34.6％。Takahashi等利用化学生物偶联法，以L-赖氨酸盐酸盐为原料，化学消旋得到质量浓度100g/L的DL-Lys反应液，再经加氧酶和脱氨酶生物降解L-Lys，混合反应液中剩余47g/L的D-Lys，结晶分离后D-Lys最终收率38％。还有报道利用化学法将L-Lys消旋后，再用蜂房哈夫尼菌(Hafniaalvei)AS1.1009菌株赖氨酸脱羧酶进行转化，30gDL-Lys经纯化回收后得到8.5gD-Lys，收率为28％。有文献报道利用氨基酸消旋酶和L-赖氨酸脱羧酶双酶级联催化法制备D-lys，从50gDL-赖氨酸中得到21gD-赖氨酸，收率42％，e.e.值为98％；还有文献报道构建表达赖氨酸消旋酶、L-赖氨酸单加氧酶和5-氨基戊酰胺氨基水解酶的基因工程大肠杆菌菌株，建立了一个两菌株耦合的全细胞生物转化系统，用于从L-赖氨酸生产D-赖氨酸，在最佳条件下，D-赖氨酸的最大值为53.5g/L，5-氨基戊酸的最大值为48.2g/L产率分别为47.4％和42.3％，D-赖氨酸e.e.值>99％。目前，工业上生成D-lys主要是化学法和化学生物偶联法，因此DL-混旋赖氨酸中L-赖氨酸的生物转化成为关键步骤。
技术实现思路
本专利技术对源于铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的L-赖氨酸脱羧酶(NC_002516.2)基因进行定向诱变，并通过高通量筛选，获得了一种酶活力和立体专一性更高、从而高效催化L-赖氨酸反应的突变酶。具体来说，本专利技术包括如下技术方案：一种L-赖氨酸脱羧酶突变体，其氨基酸序列为SEQIDNO:3：MYKDLKFPVLIVHRDIKADTVAGERVRGIAHELEQDGFSILSTASSAEGRIVASTHHGLACILVAAEGAGENQRLLQDVVELIRVARVRAPQLPIFALGEQVTIENAPAESMADLHQLRGILYLFEDTVPFLARQVARAARNYLAGLLPPFFRALVEHTAQSNYSWHTPGHGGGVAYRKSPVGQAFHQFFGENTLRSDLSVSVPELGSLLDHTGPLAEAEDRAARNFGADHTFFVINGTSTANKIVWHSMVGREDLVLVDRNCHKSILHSIIMTGAIPLYLTPERNELGIIGSIPLSEFSKQSIAAKIAASPLARGREPKVKLAVVTNSTYDGLCYNAELIKQTLGDSVEVLHFDEAWYAYAAFHEFYDGRYGMGTSRSEEGPLVFATHSTHKMLAAFSQASMIHRQDGGTRKLDVARFNEAFMMHISTSPQYGIIASLDVASAMMEGPAGRSLIQETFDEALSFRRALANVRQNLDRNDWWFGVWQPEQVEGTDQVGTHDWVLEPSADWHGFGDIAEDYVLLDPIKVTLTTPGLSAGGKLSEQGIPAAIVSRFLWERGLVVEKTGLYSFLVLFSMGITKGKWSTLVTELLEFKRCYDANLPLLDVLPSVAQAGGKRYNGVGLRDLSDAMHASYRDNATAKAMKRMYTVLPEVAMRPSEAYDKLVRGEVEAVPIARLEGRIAAVMLVPYPPGIPLIMPGERFTEATRSILDYLEFARTFERAFPGFDSDVHGLQHQDGPSGRCYTVECIKE(SEQIDNO:3)。其为来源的L-赖氨酸脱羧酶SEQIDNO:2(GeneID878596)第243位的P替换为S、第406位的V替换为R的突变体。本专利技术的第二个方面在于提供编码上述L-赖氨酸脱羧酶突变体的基因。本专利技术的第三个方面在于提供表达上述突变体SEQIDNO:3的微生物，所述微生物选自大肠杆菌、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌，优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌BL21(DE3)。通过上述微生物的发酵，可获得L-赖氨酸脱羧酶突变体。例如，在微生物发酵后，菌体用缓冲液重悬，超声破碎，离心，收集上清过柱层析，洗脱目的蛋白，即得L-赖氨酸脱羧酶突变体。本专利技术的第四个方面在于提供一种生产D-赖氨酸的方法。上述生产D-赖氨酸的外消旋体拆分反应体系可以为缓冲液体系比如磷酸盐缓冲液，pH5.0-9.0，优选pH6.0-8.0、pH6.5-7.5，例如为pH7.0。反应温度可以为20-40℃，例如25-38℃，优选28-38℃、最优选30-35℃。上述反应体系中还添加有磷酸吡哆醛(PLP)，以便作为辅酶促进酶催化反应。与来源的野生型L-赖氨酸脱羧酶SEQIDNO:2相比，本专利技术获得的L-赖氨酸脱羧酶突变体SEQIDNO:3具有更高的酶活力和更高的立体专一性，能够有效催化L-赖氨酸的脱羧反应、但不催化D-赖氨酸反应，从而通过外消旋体拆分法制备D-赖氨酸。在酶催化反应体系中D-赖氨酸产量能达到25.5g/L，e.e.值高达99.0以上，工业化应用前景广阔。附图说明图1为质粒pET28a的结构示意图，由浙江华睿生物技术有限公司研发中心惠赠。图2为用于表达L-赖氨酸脱羧酶的重组质粒pET28a-LdcA的结构示意图。具体实施方式为了获得酶活力更高、立体选择性高的L-赖氨酸脱羧酶，本专利技术利用生物信息学技术对铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)来源的L-赖氨酸脱羧酶SEQIDNO:2进行分析，判断其氨基酸序列中一些位点在酶的结构和功能方面起到关键作用。MYKDLKFPVLIVHRDIKADTVAGERVRGIAHELEQDGFSILSTASSAEGRIVASTHHGLACILVAAEGAGENQRLLQDVVELIRVARVRAPQLPIFALGEQVTIENAPAESMADLHQLRGILYLFED本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种L-赖氨酸脱羧酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3。/n

【技术特征摘要】
1.一种L-赖氨酸脱羧酶突变体，其氨基酸序列为SEQIDNO:3。


2.编码如权利要求1所述L-赖氨酸脱羧酶突变体的基因。


3.一种微生物，其表达如权利要求1所述的L-赖氨酸脱羧酶突变体。


4.如权利要求3所述的微生物，其特征在于，所述微生物选自大肠杆菌、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌。


5.如权利要求3所述的微生物，其特征在于，所述微生物是大肠杆菌BL21(DE3)。


6.一种生产如权利要求1所述L-赖氨酸脱羧酶突变体的方法，其特征在于，通过如权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：范文超，高书良，王金刚，丁鹏，
申请(专利权)人：洛阳华荣生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41