一种构建L-肌氨酸生产菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种构建L‑肌氨酸生产菌的方法，该基因工程菌能够以葡萄糖和甲胺为主要原料，通过发酵直接产生L‑肌氨酸，5L发酵罐发酵72小时，可产L‑肌氨酸18.3g/L，具有工业化应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种构建L-肌氨酸生产菌的方法
本专利技术属于代谢工程和基因工程领域，具体地说，涉及一种构建L-肌氨酸生产菌的方法、构建得到的基因工程菌及其应用。
技术介绍
L-肌氨酸是一种有机物，别名N-甲基甘氨酸，化学式为C3H7NO2，白色结晶，微有甜味，具潮解性，能溶于水，微溶于醇，不溶于醚，天然存在于海星和海胆中。主要应用于生化试剂、染料稳定剂、日用化学品、氨基酸型表面活性剂、保健药品疲劳恢复剂，是胆碱和肌酸降解的中间产物。肌氨酸作为导入神经胶质细胞的抑制剂，显示出作为抗精神病药物的潜力；肌氨酸酰化产生离子表面活性剂，用作洗发水、剃须泡沫和清洁剂的添加剂，广泛用日化行业。L-肌氨酸主要通过化学法和发酵法制备：目前化学法主要有氯乙酸法和羟基乙腈法，但生成成本高、回收困难且污染严重。发酵法制备L-肌氨酸产物浓度仍较低，最高仅达到10g/L，难以满足工业化生成需求。2014年，Zahooretal.(JournalofBiotechnology,V192,2014,P366-375.)报道了利用谷氨酸棒杆菌通过敲除内源苹果酸合成酶aceB、弱化异柠檬酸脱氢酶icd和过表达大肠杆菌来源的乙醛酸还原酶ycdW，在基本盐培养基中，可产5.3g/L乙醇酸。来自假单胞菌的N-烷基氨基酸脱氢酶(DpkA)被证明为提供微生物发酵法生产N-烷基化氨基酸的新途径，利用乙醛酸经此途径制备肌氨酸成为了可能(BiotechnologyJournal,2020,15(7).)。2019年美国伯克利大学Mindtetal.(BioresourceTechnology,2019,281.)报道了在谷氨酸棒杆菌敲除aceB、弱化icd、过表达PseudomonasputidaKT2440dpkA基因，在以木糖和乙酸钾为碳源的发酵培养中，肌氨酸产量达到8.7g/L左右；同年Mindtetal.(Frontiersinengineeringandbiotechnolgy,2019,26.)利用氨基酰基残基在底物结合位点突变的DpkAF117L，使得乙醛酸还原烷基胺化的比活性提高20％左右，并以单乙胺为基质，首次报道了N-乙基甘氨酸的发酵生产。
技术实现思路
为了探索发酵法生产L-肌氨酸的可行性，本专利技术以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为出发菌株，通过过表达大肠杆菌来源的pntAB和恶臭假单胞菌KT2440(PseudomonasputidaKT2440)来源的DpkAF117L，敲除glcB(NCgl2247)和alaT(NCgl2747)，将异柠檬酸脱氢酶(icd，NCgl0634)基因起始密码子由ATG变为GTG，构建的基因工程菌株能够以葡萄糖和甲胺为原料，通过发酵产生L-肌氨酸。具体而言，本专利技术包括如下技术方案。一种构建L-肌氨酸生产菌的方法，其包括以下步骤：A.以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为出发菌株，在基因组中整合NADPH-NAD+转氢酶(嘧啶核苷酸转氢酶A亚基(PNTA)和B亚基(PNTB))的编码基因pntAB(即pntA和pntB)，得到过表达pntAB的菌株A；B.在菌株A的基因组中整合恶臭假单胞菌KT2440(PseudomonasputidaKT2440)来源的亚胺还原酶突变体DpkAF117L编码基因，得到过表达DpkAF117L的菌株B；C.敲除菌株B基因组中的基因glcB(NCgl2247)和alaT(NCgl2747)，得到glcB(NCgl2247)和alaT(NCgl2747)缺失的菌株C；D.将菌株C基因组中的异柠檬酸脱氢酶(icd，NCgl0634)基因起始密码子由ATG变为GTG，筛选阳性克隆，得到L-肌氨酸生产菌。优选地，上述基因pntAB是大肠杆菌来源的pntAB。上述DpkAF117L编码基因是GenBank:AAN69191.1。在一种实施方式中，步骤A中基因pntAB的整合和步骤C中基因glcB(NCgl2247)的敲除可以包括下述步骤：将核苷酸序列为SEQIDNO:1的质粒pK18mobsacB-glc-pntAB转入宿主细胞中；进行SacB蔗糖反筛。上述步骤B中基因DpkAF117L的整合和步骤C中基因alaT(NCgl2747)的敲除可以包括下述步骤：将核苷酸序列为SEQIDNO:3的质粒pK18mobsacB-alaT-dpkA转入宿主细胞中；进行SacB蔗糖反筛。上述步骤D中异柠檬酸脱氢酶(icd，NCgl0634)基因起始密码子由ATG变为GTG的可以包括下述步骤：将核苷酸序列为SEQIDNO:4的质粒pK18mobsacB-icd转入宿主细胞中；进行SacB蔗糖反筛。上述步骤中的质粒转入可以是氯化钙转化法或电转化，优选电转化。本专利技术的第二个目的在于提供一种L-肌氨酸生产菌，其通过上述的方法构建和筛选得到。优选地，上述L-肌氨酸生产菌可以是谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.22265。本专利技术的第三个目的在于提供上述L-肌氨酸生产菌比如CGMCCNo.22265用于生产L-肌氨酸的用途。例如，可以通过上述L-肌氨酸生产菌比如CGMCCNo.22265的发酵来生产L-肌氨酸。在发酵时，需要将葡萄糖和甲胺作为主要原料。发酵所用的培养基可以是任何适用于谷氨酸棒杆菌生长发酵的培养基。例如，发酵培养基组成如下：葡萄糖100g/L，硫酸镁100mg/L，酵母粉35g/L，硫酸铵20g/L，FeSO4·7H2O11mg/L，柠檬酸钠10mg/L，H3PO4(85％)250μl/L，消泡剂204500mg/L，泛酸钙60mg/L，维生素PP18mg/L，thiaminHCl15mg/L，生物素15mg/L，pH7.0；发酵过程中流加甲胺。发酵温度优选是30℃。本专利技术构建的基因工程菌能够通过发酵直接产生L-肌氨酸，具有工业化开发利用价值。本专利技术构建的L-肌氨酸高产基因工程菌的拉丁学名是Corynebacteriumglutamicum，中文名称是谷氨酸棒杆菌或谷氨酸棒状杆菌，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期是2021年5月6日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.22265。附图说明图1为本专利技术构建的生物合成L-肌氨酸的代谢路线图。图2是本专利技术构建的质粒pK18mobsacB-glc-pntAB的结构示意图。其核苷酸序列为SEQIDNO:1。图3是本专利技术构建的质粒pTrc99a-dpkAF117L的结构示意图。其核苷酸序列为SEQIDNO:2。图4是本专利技术构建的质粒pK18mobsacB-alaT-dpkA的结构示意图。其核苷酸序列为SEQIDNO:3。图5是本专利技术构建的质粒pK18mobsacB-icd的结构示意图。其本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种构建L-肌氨酸生产菌的方法，其包括以下步骤：/nA.以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为出发菌株，在基因组中整合NADPH-NAD+转氢酶的编码基因pntAB，得到过表达pntAB的菌株A；/nB.在菌株A的基因组中整合恶臭假单胞菌KT2440(Pseudomonas putida KT2440)来源的亚胺还原酶突变体DpkA

【技术特征摘要】
1.一种构建L-肌氨酸生产菌的方法，其包括以下步骤：
A.以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为出发菌株，在基因组中整合NADPH-NAD+转氢酶的编码基因pntAB，得到过表达pntAB的菌株A；
B.在菌株A的基因组中整合恶臭假单胞菌KT2440(PseudomonasputidaKT2440)来源的亚胺还原酶突变体DpkAF117L编码基因，得到过表达DpkAF117L的菌株B；
C.敲除菌株B基因组中的基因glcB(NCgl2247)和alaT(NCgl2747)，得到glcB(NCgl2247)和alaT(NCgl2747)缺失的菌株C；
D.将菌株C基因组中的异柠檬酸脱氢酶(icd，NCgl0634)基因起始密码子由ATG变为GTG，筛选阳性克隆，得到L-肌氨酸生产菌。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因pntAB是大肠杆菌来源的pntAB。


3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A中基因pntAB的整合和步骤C中基因glcB(NCgl2247)的敲除包括下述步骤：将核苷酸序列为SEQIDNO:1的质粒pK18mobsacB-glc-pntAB导入宿主细胞中；进行SacB蔗糖反筛。


4.如权利要求1或4所述的方法，其特征在于，步骤B中基因DpkAF117L的整合和步骤C中基因alaT(NCgl2747)的敲除包括下述步骤：将核苷酸序列为SEQIDNO:3的质粒pK18mobsa...

【专利技术属性】
技术研发人员：范文超，高书良，丁鹏，
申请(专利权)人：洛阳华荣生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41