一种高产N-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法、应用技术

本发明专利技术涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种高产N‑乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法、应用。所述高产N‑乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌为表达宿主，将N‑乙酰神经氨酸合成酶基因neuB和N‑乙酰葡萄糖胺2‑差向异构酶基因neuC整合到枯草芽孢杆菌基因组上稳定表达，然后通过在质粒上过表达磷酸葡萄糖胺变位酶基因glmM和果糖6‑磷酸转氨酶基因glmS。本发明专利技术通过基因工程技术对

【技术实现步骤摘要】
一种高产N-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法、应用
本专利技术涉及生物工程
，尤其涉及一种高产N-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法、应用。
技术介绍
唾液酸(sialicacid,SA)是一类含有9个碳原子并具有吡喃糖结构的酸性氨基糖，又称神经氨酸，广泛存在于植物、动物和微生物中，且种类繁多，目前已发现的有50多种，包括N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)、N-甘酰神经氨酸(Neu5Gc)和去氨基神经氨酸(KDN)等；而N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)是其中最重要的一种唾液酸，它的含量占唾液酸家族的99％以上，是其他唾液酸合成的前体物质，通常位于细胞膜表面糖链的末端，参与多种生理功能。目前，唾液酸以及其各类衍生产品已经在食品、药品和疾病诊断等多个领域得到了广泛的应用，主要具有提高婴儿的智力和记忆力、抗老年痴呆、抗识别、抗病毒、抗炎和抗肿瘤以及提高肠道对矿物质和维生素的吸收等功能。目前，N-乙酰神经氨酸的生产途径有从禽蛋、牛奶和燕窝等含量丰富的天然材料中提取，该方法获得的产物易引起过敏反应；或者是通过化学法合成，但该方法存在底物成本高、产物产率低、污染严重；或者是全细胞催化法生产，该法存在转化率低、底物成本高、分离步骤复杂、产物存在内毒素等问题。再或者通过构建高产N-乙酰神经氨酸的基因工程菌，通过发酵法直接生产。但目前主要采用的是大肠杆菌为宿主，大肠杆菌本身属于条件致病菌，其产品在用于食品领域，尤其是婴幼儿食品中，可能存在安全性问题。
技术实现思路
本专利技术为了克服上述现有技术中存在的问题，提供了一种高产N-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌。本专利技术还提供了一种高产N-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌的构建方法。本专利技术还提供了一种高产N-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌在发酵生产N-乙酰神经氨酸中的应用。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种高产N-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌，以枯草芽孢杆菌为表达宿主，将N-乙酰神经氨酸合成酶基因neuB和N-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶基因neuC整合到枯草芽孢杆菌基因组上稳定表达，然后通过在质粒上过表达磷酸葡萄糖胺变位酶基因glmM和果糖6-磷酸转氨酶基因glmS。本专利技术的重组枯草芽孢杆菌是通过外源表达N-乙酰神经氨酸合成酶neuB和N-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶neuC两个酶，结合枯草杆菌本身就有的从甘油或葡萄糖到UDP-N-乙酰氨基葡萄糖的合成途径，搭建出完整的N-乙酰神经氨酸合成途径，然后将neuBC的表达元件通过CRISPR系统整合到染色体上，再过表达的N-乙酰神经氨酸合成的两个限速酶(磷酸葡萄糖胺变位酶基因glmM和果糖6-磷酸转氨酶基因glmS)，最终实现高产N-乙酰神经氨酸的目的。所述枯草芽孢杆菌优选为枯草芽孢杆菌168(Bacillussubtilis168；简称B.subtilis168)。所述重组枯草芽孢杆菌是以B.subtilis-Pgrac-neuBC为宿主菌株构建得到的。作为优选，以质粒pHT01为表达载体，以诱导型启动子Pgrac过表达磷酸葡萄糖胺变位酶基因glmM和果糖6-磷酸转氨酶基因glmS。作为优选，所述诱导型启动子Pgrac的核苷酸序列为SEQIDNO.1。作为优选，所述磷酸葡萄糖胺变位酶基因glmM的核苷酸序列为SEQIDNO.2；所述果糖6-磷酸转氨酶基因glmS的核苷酸序列为SEQIDNO.3。作为优选，所述B.subtilis-Pgrac-neuBC是通过全基因合成C.jejuni来源的N-乙酰神经氨酸合成酶基因neuB和N-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶基因neuC，克隆到整合质粒pJOE8999上，重组于B.subtilis168基因组上，neuBC的核苷酸序列为SEQIDNO.4。作为优选，所述磷酸葡萄糖胺变位酶基因glmM来源于枯草芽孢杆菌或能表达相同功能酶的微生物。作为优选，所述果糖6-磷酸转氨酶基因glmS来源于大肠杆菌或能表达相同功能酶的微生物。一种高产N-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，包括以下步骤：(1)将N-乙酰神经氨酸合成酶基因neuB、N-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶基因neuC重组于枯草芽孢杆菌基因组；具体位置是淀粉酶amyE基因上；(2)在质粒上过表达磷酸葡萄糖胺变位酶基因glmM和果糖6-磷酸转氨酶基因glmS，即得高产N-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌。作为优选，步骤(1)的具体步骤为：克隆N-乙酰神经氨酸合成酶基因neuB和N-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶基因neuBC，克隆Pgrac启动子基因序列和淀粉酶amyE两侧同源臂基因序列，4段基因通过OverlapPCR组装。作为优选，步骤(2)的具体步骤为：(a)以枯草芽孢杆菌基因组DNA为模板PCR扩增获得glmM基因片段；(b)以大肠杆菌菌株基因组DNA为模板PCR扩增获得glmS基因片段；(c)以glmM片段和glmS片段为模板PCR扩增获得glmM-glmS基因片段；(d)通过酶切连接克隆至表达载体pHT01上。一种高产N-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌的应用，以甘油为底物，采用所述重组枯草芽孢杆菌发酵生产N-乙酰神经氨酸。作为优选，发酵生产N-乙酰神经氨酸具体包括以下步骤：1)活化培养菌种，发酵培养基(g/L)：甘油20，胰蛋白胨3，酵母粉1，MgSO4·7H20，补料培养基(g/L)：甘油800，酵母浸膏100，胰蛋白胨30；在发酵培养基中接种重组枯草芽孢杆菌；2)将培养好的种子逐级放大，并在相应的发酵罐中进行好气培养，温度控制在37℃，pH通过氨水调控至6.8，溶氧保持在30％，同时补充合适的碳氮源；3)加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，诱导相关蛋白的表达。因此，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术通过基因工程技术对B.subtilis进行改造，使其可以以甘油为底物直接合成N-乙酰神经氨酸，生产工艺简单、环境友好、无内毒素，可用于食品领域，具有工业化生产价值。附图说明图1是B.subtilis中甘油到N-乙酰神经氨酸的合成途径。图2是BsBC、BsBCpM、BsBCpS和BsBCpMS的发酵数据图。具体实施方式下面通过具体实施例，并结合附图，对本专利技术的技术方案作进一步具体的说明。在本专利技术中，若非特指，所有设备和原料均可从市场购得或是本行业常用的，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域常规方法。实施例1：基因组上表达neuBC基因的重组菌株Bs-neuBC构建一、neuBC基因整合质粒pJOE8999-gRNA-L-Pgrac-neuBC-R的构建1)根据neuBC的基因序列(GenBankNo.AF100048)全基因合成neuBC基因，两端添加BamHⅠ和XbaⅠ位点；2)将合成本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高产N-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，以枯草芽孢杆菌为表达宿主，将N-乙酰神经氨酸合成酶基因neuB和N-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶基因neuC整合到枯草芽孢杆菌基因组上稳定表达，然后通过在质粒上过表达磷酸葡萄糖胺变位酶基因glmM和果糖6-磷酸转氨酶基因glmS。/n

【技术特征摘要】
1.一种高产N-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，以枯草芽孢杆菌为表达宿主，将N-乙酰神经氨酸合成酶基因neuB和N-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶基因neuC整合到枯草芽孢杆菌基因组上稳定表达，然后通过在质粒上过表达磷酸葡萄糖胺变位酶基因glmM和果糖6-磷酸转氨酶基因glmS。


2.根据权利要求1所述的一种高产N-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，以质粒pHT01为表达载体，以诱导型启动子Pgrac过表达磷酸葡萄糖胺变位酶基因glmM和果糖6-磷酸转氨酶基因glmS。


3.根据权利要求2所述的一种高产N-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述诱导型启动子Pgrac的核苷酸序列为SEQIDNO.1。


4.根据权利要求1所述的一种高产N-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述磷酸葡萄糖胺变位酶基因glmM的核苷酸序列为SEQIDNO.2；所述果糖6-磷酸转氨酶基因glmS的核苷酸序列为SEQIDNO.3。


5.根据权利要求1所述的一种高产N-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述磷酸葡萄糖胺变位酶基因glmM来源于枯草芽孢杆菌或能表达相同功能酶的微生物。


6.根据权利要求1所述的一种高产N-乙酰神经氨酸的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述果糖6-磷酸转氨酶基因glmS来源于大肠杆菌或能表达相同功能酶的微生物。<...

【专利技术属性】
技术研发人员：竹国津，柳鹏福，储消和，陈艳，郭倩，韩笑笑，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33