恶臭假单胞菌基因工程菌及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了恶臭假单胞菌基因工程菌及其构建方法和应用。将来自于铜绿假单胞菌(

【技术实现步骤摘要】
恶臭假单胞菌基因工程菌及其构建方法和应用
本专利技术属于微生物及基因工程
，具体涉及恶臭假单胞菌基因工程菌及其构建方法和应用。
技术介绍
鼠李糖脂作为一种高效的生物表面活性，可以显著降低界面表面张力，乳化性能优异，可促进烃类、油脂类等疏水底物的降解，具有高生物降解性及环境友好的特性，已在化工，医药，化妆，石油后期采收和环境污染治理等行业中获得广泛的应用。铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)是研究的最多的鼠李糖脂产生菌，可以在疏水性底物例如植物油上生长，其鼠李糖脂生产机制明晰。但是，铜绿假单胞菌又名绿脓杆菌，是一种人体机会性致病菌，会带来一系列的安全问题，不能大规模工业化应用。因此，人们期望利用相对安全的工业微生物进行鼠李糖脂的生产。鼠李糖脂的异源生产可以将鼠李糖脂的生物合成与复杂的群体感应调控分开。其中，恶臭假单胞菌（PseudomonasputidaKT2440）是一种GRAS认证环境安全的非致病性假单胞菌种，遗传背景清晰，产物的生物合成过程不受细胞群体感应的影响，可进行外源诱导物的人工调控合成。同时具有出色的降解芳香族化合物的能力以及在恶劣条件下的强大生存能力，因此是生物修复，代谢工程和生物催化的理想底盘，并且很多基因组编辑方法已应用于恶臭假单胞菌。鼠李糖脂的生产菌铜绿假单胞菌可以很好的利用植物油生长并生产，然而，恶臭假单胞菌本身并不能利用植物油生长。
技术实现思路
本专利技术的目的在于实现由安全的工业微生物高效利用植物油进行鼠李糖脂的生产。为达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种恶臭假单胞菌基因工程菌，所述基因工程菌通过在宿主菌中表达铜绿假单胞菌来源的鼠李糖脂合成相关基因簇rhlIRBA获得；所述基因簇rhlIRBA的核苷酸序列如SEQIDNO：1或SEQIDNO：2所示。进一步的，所述基因簇rhlIRBA构建在质粒pBBRmcs-5上。进一步的，所述宿主菌为恶臭假单胞菌KT2440。本专利技术的另一目的在于提供上述恶臭假单胞菌基因工程菌的构建方法，包括：（1）根据基因簇rhlIRBA序列设计引物，以铜绿假单胞菌基因组DNA为模板，扩增出rhlIRBA全序列，酶切一步克隆方式插入质粒，获得表达质粒；（2）制备宿主菌电转感受态，将表达质粒电转至宿主菌电转感受态细胞中，获得所述恶臭假单胞菌基因工程菌。本专利技术的又一目的在于提供上述恶臭假单胞菌基因工程菌在产鼠李糖脂中的应用。本专利技术所述基因工程菌能够以植物油为碳源发酵。所述基因工程菌在添加庆大青霉素的种子培养基中进行种子培养。进一步的，所述基因工程菌在180-200rpm、pH7.0-7.2、30℃条件下发酵培养。进一步的，所述基因工程菌所产鼠李糖脂为单鼠李糖脂。进一步的，所述基因工程菌发酵培养的培养基组分为：菜籽油60g/L；硝酸钠7.7g/L；氯化钠1.0g/L；氯化钾0.1g/L；氯化钙0.01g/L；磷酸二氢钾3.5g/L；磷酸氢二钠3.5g/L；硫酸镁0.26g/L；硫酸铁0.001g/L；酵母粉0.5g/L；微量元素：3.8mL/L；微量元素组成：三氯化铁0.08g/L；硫酸锌0.75g/L；硫酸铜0.075g/L；硫酸锰0.75g/L；硼酸0.15g/L。本专利技术扩增出不同来源恶臭假单胞菌的rhlIRBA基因簇，针对两种不同来源rhlIRBA所构建的质粒pBBRmcs5-rhlIRBA(f.KT1115)和pBBRmcs5-rhlIRBA(f.PAO1)均可在恶臭假单胞菌KT2440中表达并可产生鼠李糖脂生物表面活性剂，且只产生单鼠李糖脂（Rha-C10-C10），原始铜绿假单胞菌菌合成的是成分复杂的单双鼠李糖脂混合物。其中P.putidaKT2440-pBBRmcs5-rhlIRBA(f.KT1115)可以更好的利用植物油生产更多的鼠李糖脂。同时，恶臭假单胞菌为GRAS认证安全菌株，所述恶臭假单胞菌工程菌株，避免了铜绿假单胞菌的致病性，提高了培养生产过程的安全性；避免了铜绿假单胞菌中鼠李糖脂合成受细胞群体感应调控的特点；能够利用廉价的植物油为碳源合成鼠李糖脂；产物单一，只合成单鼠李糖脂（Rha-C10-C10）。附图说明图1为P.putidaKT2440-pBBRmcs5-rhlIRBA(f.KT1115)和KT2440-pBBRmcs5-rhlIRBA(f.PAO1)发酵结果图。图2为表达质粒图谱；A：pBBRmcs5-rhlIRBA(f.KT1115)质粒；B：pBBRmcs5-rhlIRBA(f.PAO1)质粒。图3为P.aeruginosaKT1115，P.putidaKT2440-pBBRmcs5-rhlIRBA(f.KT1115)和P.putidaKT2440-pBBRmcs5-rhlIRBA(f.PAO1)发酵产物薄层色谱（TLC）分析图。具体实施方式下面的实施例将对本专利技术所提供的方法予以进一步的说明，但本专利技术不限于所列出的实施例，还应包括在本专利技术所要求的权利范围内其它任何公知的改变。实施例使用的宿主菌为恶臭假单胞菌（Pseudomonasputida）KT2440，购自中国微生物菌种保藏中心。实施例1恶臭假单胞菌工程菌构建方法1、P.aeruginosaKT1115与P.aeruginosaPAO1来源的提供鼠李糖脂合成关键基因的克隆根据鼠李糖脂合成相关的基因簇（rhlIRBA）序列设计引物，正向引物为5’-GACTCACTATAGGGCGAATTGGAGCTCCCGTCCTGTGAAATCTGGCA-3’，引物5’端引入26bp同源臂（pBBRmcs-5中SacI酶切位点上游，下划线标出）；5’-CGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCGAGCATGCGGCAGGAGAAGCG-3’，引物5’端引入26bp同源臂（pBBRmcs-5中EcoRI酶切位点下游，下划线标出）。分别以铜绿假单胞菌P.aeruginosaPAO1和P.aeruginosaKT1115基因组DNA为模板，扩增出鼠李糖脂合成相关的基因簇（rhlIRBA）全序列。两种rhlIRBA核昔酸序列分别如SEQIDNO：1、SEQIDNO：2所示。2、鼠李糖脂生产质粒的构建所用表达质粒载体为pBBRmcs-5。将pBBRmcs-5质粒进行双酶切（EcoRI-HF，SacI-HF，购自南京伟沃生物科技有限公司），使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司ClonExpress®IIOneStepCloningKit非连接酶依赖型单片段快速克隆试剂盒，将两种来源的rhlIRBA分别连接到载体pBBRmcs5，将其转化到E.coliDH5α感受态细胞中。E.coliDH5α感受态细胞购自南京良纬生物科技有限公司。菌落PCR筛选阳性克隆，提质粒送至北京擎科生物科技有限公司测序，测序正确后命名该质粒pBBRmcs5-rhlIRB本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种恶臭假单胞菌基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌通过在宿主菌中表达铜绿假单胞菌来源的鼠李糖脂合成相关基因簇rhlIRBA获得；所述基因簇rhlIRBA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种恶臭假单胞菌基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌通过在宿主菌中表达铜绿假单胞菌来源的鼠李糖脂合成相关基因簇rhlIRBA获得；所述基因簇rhlIRBA的核苷酸序列如SEQIDNO：1或SEQIDNO：2所示。


2.根据权利要求1所述的恶臭假单胞菌基因工程菌，其特征在于，所述基因簇rhlIRBA构建在质粒pBBRmcs-5上。


3.根据权利要求1所述的恶臭假单胞菌基因工程菌，其特征在于，所述宿主菌为恶臭假单胞菌KT2440。


4.权利要求1~3任一项所述恶臭假单胞菌基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括：
（1）根据基因簇rhlIRBA序列设计引物，以铜绿假单胞菌基因组DNA为模板，扩增出rhlIRBA全序列，酶切一步克隆方式插入质粒，获得表达质粒；
（2）制备宿主菌电转感受态，将表达质粒电转至宿主菌电转感受态细胞中，获得所述恶臭假单胞菌基因工程菌。


5.权利要求1~3任一项所述恶臭假单胞菌基因工程菌在产鼠李糖脂中的应用。

【专利技术属性】
技术研发人员：钱秀娟，刘豪杰，董维亮，刘仕勋，周杰，姜岷，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32