一种以紫色杆菌素为输出信号的汞离子微生物全细胞生物传感器的构建及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种以紫色杆菌素为输出信号的汞离子微生物全细胞生物传感器的构建及应用。本发明专利技术提供了一种重组菌，是通过向受体菌中导入重组载体A后所得；所述重组载体A中含有DNA片段A；在所述DNA片段A上，含有mer双向启动子，所述mer双向启动子的一侧为MerR蛋白编码基因，另一侧为紫色杆菌素合成基因模块。本发明专利技术重组菌可以作为以紫色杆菌素为输出信号的汞离子微生物全细胞生物传感器使用。一方面，可以通过细胞颜色的改变实现靶重金属暴露的定性指示，另一方面，可以通过有机溶剂萃取胞内紫色杆菌素，采用比色进行靶重金属定量分析。

【技术实现步骤摘要】
一种以紫色杆菌素为输出信号的汞离子微生物全细胞生物传感器的构建及应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种以紫色杆菌素为输出信号的汞离子微生物全细胞生物传感器的构建及应用。
技术介绍
汞是一种长期存在于大气中且具有全球迁移性的环境污染物。人类对汞毒性的认识已经长达几个世纪，上世纪50年代发生了因为汞的环境暴露对人体健康带来重大影响的事件，即日本的水俣病事件。汞有几种不同的化学形态，包括元素汞、有机汞和无机汞。其中Hg(II)可直接由生物细胞摄入，并代谢生成毒性最强的有机形态甲基汞。全细胞生物传感器直接模拟环境微生物检测可生物利用形态的靶金属，使其在环境污染监测方面具有不可替代的地位。环境重金属污染物进行合理、准确的监测是开展污染防治工作的重要前提。目前环境重金属毒物的检测主要是理化分析方法，如电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-AES)、电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)等，这类方法的优点是具有高检测灵敏度和高特异性，但也存在一定不足，如设备昂贵、操作专业技术要求高、检测周期长等。最重要的是，传统理化分析方法主要针对环境重金属元素总量进行测定，检测结果难以真实反应有毒形态重金属的水平，尤其是有毒重金属的生物利用度。深入了解并把握在自然界中以各种化学状态或化学形态存在的重金属元素与生命体之间的相互关系，使之更加可持续地应用到人类的生产生活中，是我们所面临的重大挑战。基于生物有机体的生物传感技术的问世，凭借其可以直接反映污染物对生物有机体的毒性和影响的优势，近年来成为研究热点。微生物细胞具有繁殖快、易储存、稳定性高等特点，以微生物细胞为载体的生物传感器的问世可以极大简化靶分子检测流程，检测结果直接反映了有毒污染物水平及其生物利用度。紫色杆菌素(violacein)是由环境细菌，尤其是紫色色杆菌(Chromobacteriumviolaceum)产生的醇溶性色素。紫色杆菌素凭借其迷人的紫色从一发现就吸引了学者的关注，目前已成为研究细菌群体感应(quorumsensing)的有力工具。进一步研究表明紫色杆菌素紫色杆菌素具有广谱的抗菌及抗肿瘤活性，其作为药物先导化合物需求不断增加。随着紫色杆菌素紫色杆菌素合成途径的阐明，其异源合成已成为可能。由于大多数重金属离子的电子层、结构、价态等物理和化学性质极为接近，通过化学合成法获得高选择性的金属离子探针难度大。生活在重度污染的极端环境中的微生物，演化出了一套简单、高效的诱导型操纵子系统，用以维持有毒重金属在菌体内的动态平衡。这类诱导型操纵子的“开关”所涉及的靶金属离子与调控蛋白(金属结合蛋白)、DNA序列(启动子区域)等生物大分子之间微妙的作用，历经亿万年的自然进化，其高效性和特异性超出了化学家所能进行的分子设计范围。这类生物大分子正是开发特异性识别金属离子的生物传感器的一个重要突破口。金属结合蛋白是这类操纵子的关键转录调控因子，依据这类转录因子的序列同源性至少可分为10个家族，各家族成员与靶金属离子的结合具有高度选择性，个别氨基酸的突变就可改变结合的特异性。靶金属离子的存在是这类调控因子启动转录的关键，利用启动子区域DNA序列为蓝本设计核酸荧光探针，目前已开发出了特异识别Hg(II)、Pb(II)、Cd(II)、Cu(I)、Ag(I)、Au(I)等的生物传感器，可对纳摩数量级的靶金属离子进行检测，目标离子与其背景最接近的离子间的选择性都在200倍以上，有些甚至超过了1000倍。目前，尚未有以紫色杆菌素为输出信号的汞离子微生物全细胞生物传感器的相关报道。
技术实现思路
本专利技术要求保护一种以紫色杆菌素为输出信号的汞离子微生物全细胞生物传感器的构建及应用。第一方面，本专利技术要求保护一种重组菌。本专利技术所要求保护的重组菌是通过向受体菌中导入重组载体A后所得。所述重组载体A中含有DNA片段A。在所述DNA片段A上，含有mer双向启动子，所述mer双向启动子的一侧为MerR蛋白编码基因，另一侧为紫色杆菌素合成基因模块。所述紫色杆菌素合成基因模块以多顺反子形式组装，编码VioA蛋白、VioB蛋白、VioC蛋白、VioD蛋白和VioE蛋白。所述mer双向启动子的核苷酸序列为SEQIDNo.1的第442-512位。所述MerR蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。所述VioA蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.3所示。所述VioB蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.4所示。所述VioC蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.5所示。所述VioD蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.6所示。所述VioE蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.7所示。所述MerR蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQIDNo.1的第7-441位的反向互补序列。所述VioA蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQIDNo.1的第555-1811位。所述VioB蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQIDNo.1的第1829-4825位。所述VioC蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQIDNo.1的第4843-6165位。所述VioD蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQIDNo.1的第6183-7334位。所述VioE蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQIDNo.1的第7352-7924位；进一步地，所述紫色杆菌素合成基因模块的核苷酸序列为SEQIDNo.1的第555-7924位。更进一步地，所述DNA片段A的核苷酸序列为SEQIDNo.1。所述重组载体A为将所述DNA片段A替换pET-21a(+)质粒的酶切位点BglII和SacI之间的小片段后所得。在本专利技术中，所述受体菌为大肠杆菌。进一步地，所述大肠杆菌为大肠杆菌TOP10。第二方面，本专利技术要求保护第一方面中所述重组菌在作为或制备以紫色杆菌素为输出信号的汞离子微生物全细胞生物传感器中的应用。第三方面，本专利技术要求保护如下任一产品或应用：P1、前文第一方面中所述的重组载体A；P2、前文第一方面中所述的DNA片段A；P3、P1中所述重组载体A或P2中所述DNA片段A在制备前文第一方面中所述重组菌中的应用；P4、成套产品I，含有前文第一方面中所述重组菌和不溶于水的醇类溶液；P5、成套产品II，含有前文第一方面中所述重组菌、不溶于水的醇类溶液和作为标准品的汞离子；P6、P1中所述重组载体A或P2中所述DNA片段A或P4所述成套产品I或P5所述成套产品II或前文第一方面中所述重组菌在检测汞离子中的应用。进一步地，所述检测汞离子为对液体样本进行汞离子的定性和/或定量检测。其中，所述成套产品I可以用于定性检测；所述成套产品II可以用于定量检测。其中，所述液体样本满足如下条件：将所述重组菌置于所述液体样本中5-12h，所述重组菌的生长和繁殖能够正常进行。如9体积待测水样与1体积10倍浓缩的LB液体培养基混合后样本。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.重组菌，是通过向受体菌中导入重组载体A后所得；/n所述重组载体A中含有DNA片段A；/n在所述DNA片段A上，含有mer双向启动子，所述mer双向启动子的一侧为MerR蛋白编码基因，另一侧为紫色杆菌素合成基因模块。/n

【技术特征摘要】
1.重组菌，是通过向受体菌中导入重组载体A后所得；
所述重组载体A中含有DNA片段A；
在所述DNA片段A上，含有mer双向启动子，所述mer双向启动子的一侧为MerR蛋白编码基因，另一侧为紫色杆菌素合成基因模块。


2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于：所述紫色杆菌素合成基因模块以多顺反子形式组装，编码VioA蛋白、VioB蛋白、VioC蛋白、VioD蛋白和VioE蛋白。


3.根据权利要求1或2所述的重组菌，其特征在于：所述mer双向启动子的核苷酸序列为SEQIDNo.1的第442-512位；和/或
所述MerR蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示；和/或
所述VioA蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.3所示；和/或
所述VioB蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.4所示；和/或
所述VioC蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.5所示；和/或
所述VioD蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.6所示；和/或
所述VioE蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.7所示。


4.根据权利要求1-3中任一所述的重组菌，其特征在于：所述MerR蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQIDNo.1的第7-441位的反向互补序列；和/或
所述VioA蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQIDNo.1的第555-1811位；和/或
所述VioB蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQIDNo.1的第1829-4825位；和/或
所述VioC蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQIDNo.1的第4843-6165位；和/或
所述VioD蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQIDNo.1的第6183-7334位；和/或
所述VioE蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQIDNo.1的第7352-7924位；
进一步地，所述紫色杆菌素合成基因模块的核苷酸序列为SEQIDNo.1的第555-7924位；
更进一步地，所述DNA片段A的核苷酸序列为SEQIDNo.1。


5.根据权利要求1-4中任一所述的重组菌，其特征在于：所述重组载体A为将所述DNA片段A替换pET-21a(+)质粒的酶切位点BglII和SacI之间的小片段后所得。


6.根据权利要求1-5中任一所述的重组菌，其特征在于：所述受体菌为大肠杆菌；
进一步地，所述大肠杆菌为大肠杆菌TOP10。


7.权利要求1-6中任一所述重组菌在作为或制备以紫色杆菌素为输出信号的汞离子微生物全细胞生物传感器中的应用。


8.如下任一产品或应用：
P1、权利要求1-6中任一所述的重组载体A；
P2、权利要求1-6中任一所述的DNA片段A；
P3、P1中所述重组载体A或P2中...

【专利技术属性】
技术研发人员：惠长野，郭妍，杨学琴，林怡然，黄红英，李丽梅，
申请(专利权)人：深圳市职业病防治院，
类型：发明
国别省市：广东;44