【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物催化，具体地说，涉及一种稳定性高的用于合成d-色氨酸的色氨酸酶。
技术介绍
1、色氨酸又称α-氨基-β-吲哚丙酸，有l-型和d-型两种旋光异构体。d-色氨酸作为一种非蛋白活性氨基酸，具有特殊的生理学性质，在食品饲料工业以及农业中可以作为非营养甜味剂、饲料添加剂、植物生长剂，在医药行业中，主要用于合成各种多肽，代替l-色氨酸延长肽类药物的半衰期并降低副作用而成为酶抑制剂的重要合成前体；d-色氨酸和胸腺嘧啶组成的药物可治疗恶性肿瘤，增强人体免疫力。由于d-色氨酸侧链肽键很难被β-内酰酶水解，用来代替氨基酸类抗生素中l-色氨酸，可避免产生抗药性。
2、目前，d-色氨酸制备主要是通过合成n-乙酰-dl-色氨酸，然后经选择性水解得到n-乙酰-d-色氨酸，最后水解得到目标产物；也有通过先合成dl-色氨酸，然后经拆分制得d-色氨酸。但上述方法均易发生副反应，且原料价格偏高，分离困难，收率低等缺点不宜进行工业化大规模生产。
3、生物合成法近年来有了长足发展。专利技术人在数年前公开的专利cn110904086a报道了使用一种表达色氨酸酶突变体的大肠杆菌工程菌可以催化d-丝氨酸和吲哚反应合成d-色氨酸。由于使用大肠杆菌菌体作为催化剂有一些不方便之处，比如不同发酵培养批次的菌体酶活力不稳定，存在批次间差异，导致在反应液中投料量不固定，需要临用前及时检测酶活性才能确定投料量，故改为酶形式(包括游离酶或树脂固定化酶)投料。但在中试规模的搅拌釜实验中发现，催化反应过程中酶的稳定性相比菌体形式要明显下降，存在较高的底
技术实现思路
1、为了克服酶的稳定性低的缺陷，专利技术人在专利cn110904086a中报道的色氨酸酶基础上，重新进行突变体筛选。专利技术人基于大肠杆菌(escherichia coli)来源的色氨酸酶seqid no:1和其突变体的结构模型，通过基因工程技术对野生型色氨酸酶seq id no:1中的58个位点进行组合式定点突变改造和筛选，最终获得了一个耐受高浓度d-丝氨酸、吲哚和d-色氨酸环境的几乎没有底物/产物抑制性的色氨酸酶突变体，该突变体在呈游离酶使用时，适应于高机械剪切力的搅拌釜反应器，能够长时间保持酶活性稳定性。因此，本专利技术包括如下技术方案。
2、一种用于合成d-色氨酸的稳定性高的色氨酸酶突变体，其氨基酸序列为seq idno:3：
3、menfkhlpepfrihviepvkrttrayreeaiiksgmnpflldsedvfidlltdsgtgavtqsmqaammrgdeaysgsrsyyalaesvknifgysytipthqgrgaeqiyipvlikkreqekgldrskmvafsnyffdttqghsqingctvrnvyikeafdtgvrydfkgnfdleglergieevgpnnvpyivatitsnsagtqpvslanlkamysiakkydipvvmdsarfaenayfikqreaeykdwtieqitretykyadmlamsakkdamvpmggllcmkddsffdvytecrtlcvvqegfptyggleggamerlavglydgmnldwlayriaqvqylvdgleeigvvcqqagghaafvdagkllphipadqfpaqalacelykvagiraveigsfllgrdpktgkqlpcpaellrltipratytqthmdfiieafkhvkenaanikgltftyepkvlrhftaklkev(seq id no:3)。
4、该突变体为野生酶seq id no:1(genbank:caq34053.1即ncbi登录号np_418164.4)第14位r替换为h、第94位q替换为s、第202位g替换为t的突变体：
5、menfkhlpepfrirviepvkrttrayreeaiiksgmnpflldsedvfidlltdsgtgavtqsmqaammrgdeaysgsrsyyalaesvknifgyqytipthqgrgaeqiyipvlikkreqekgldrskmvafsnyffdttqghsqingctvrnvyikeafdtgvrydfkgnfdleglergieevgpnnvpyivatitsnsaggqpvslanlkamysiakkydipvvmdsarfaenayfikqreaeykdwtieqitretykyadmlamsakkdamvpmggllcmkddsffdvytecrtlcvvqegfptyggleggamerlavglydgmnldwlayriaqvqylvdgleeigvvcqqagghaafvdagkllphipadqfpaqalacelykvagiraveigsfllgrdpktgkqlpcpaellrltipratytqthmdfiieafkhvkenaanikgltftyepkvlrhftaklkev(seq id no:1)。
6、本专利技术的第二个方面提供了编码上述色氨酸酶突变体的基因。
7、优选地，编码上述色氨酸酶突变体seq id no:3的基因可以为核苷酸序列seq idno:4所示的多核苷酸、或者与seq id no:4有90％以上、优选92％以上、优选95％以上、优选97％以上、优选98％以上、更优选99％以上同源性的多核苷酸。
8、本专利技术还提供了包含上述基因的质粒。上述质粒可以是psh质粒或者pet载体例如pet22b、pet24a、pet28a。
9、本专利技术还提供了表达上述色氨酸酶突变体的微生物，例如是基因组中整合了编码上述色氨酸酶突变体seq id no:3的基因例如seq id no:4，或者是转化了上述质粒的工程菌。
10、本专利技术的另一个方面提供了一种合成d-色氨酸的方法，其包括如下步骤：以d-丝氨酸和吲哚为底物，使用上述的色氨酸酶突变体seq id no:3进行催化，得到目标产物d-色氨酸。
11、上述色氨酸酶突变体可以呈酶形式、或者呈其表达微生物菌体形式。
12、在一种实施方式中，在反应体系中加入一定量的磷酸吡哆醛(plp)作为辅酶，用于促进合成反应。
13、上述反应体系ph值为6.5-8.5、优选ph 6.9-8.2、优选ph 7.1-8.0、优选ph 7.2-7.8、优选ph 7.3-7.6，例如ph 7.5左右。
14、上述反应体系的反应温度为25-50℃、优选28-48℃、优选30-45℃、优选32-42℃、优选35-40℃，例如37℃左右。
15、本专利技术筛选出的色氨酸酶seq id no:3即便以游离酶形式用于催化底物d-丝氨酸和吲哚合成d-色氨酸的反应，也几乎没有底物/产物抑制性，且适应搅拌釜的高剪切环境，能够保持酶活性稳定，因而可以显著提高底物浓度，为工业规模生产d-色氨酸提供保障。
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1.一种用于合成D-色氨酸的色氨酸酶突变体，其特征在于，氨基酸序列为SEQ IDNO:3。
2.编码如权利要求1所述色氨酸酶突变体的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，编码色氨酸酶突变体SEQ ID NO:3的基因为核苷酸序列SEQ ID NO:4所示的多核苷酸、或者与SEQ ID NO:4有90％以上同源性的多核苷酸。
4.包含如权利要求3所述基因的质粒。
5.表达如权利要求1所述色氨酸酶突变体的微生物，其特征在于，基因组中整合了如权利要求3所述的基因，或者转化了如权利要求4所述的质粒。
6.一种合成D-色氨酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：以D-丝氨酸和吲哚为底物，使用如权利要求1所述的色氨酸酶突变体进行催化，得到目标产物D-色氨酸。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述色氨酸酶突变体呈酶形式、或者呈表达微生物菌体形式。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，反应体系中加入一定量的磷酸吡哆醛作为辅酶，用于促进合成反应。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于
10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，反应温度为25-50℃。
...【技术特征摘要】
1.一种用于合成d-色氨酸的色氨酸酶突变体，其特征在于，氨基酸序列为seq idno:3。
2.编码如权利要求1所述色氨酸酶突变体的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，编码色氨酸酶突变体seq id no:3的基因为核苷酸序列seq id no:4所示的多核苷酸、或者与seq id no:4有90％以上同源性的多核苷酸。
4.包含如权利要求3所述基因的质粒。
5.表达如权利要求1所述色氨酸酶突变体的微生物，其特征在于，基因组中整合了如权利要求3所述的基因，或者转化了如权利要求4所述的质粒。...
【专利技术属性】
技术研发人员：范文超，
申请(专利权)人：洛阳华荣生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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